電気生理学的記録を用いた共培養における神経接続形成の評価

要約

出典:Su, C. T. E., et al.共培養システムにおけるニューロン接続の形成を評価するための光遺伝学的アプローチ。J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオは、iPS細胞由来ニューロンとラット皮質ニューロンとの間の神経接続を評価するための電気生理学的記録を実演し、光感受性イオンチャネルを活性化し、シナプス後電流を検出することにより、共培養におけるシナプス接触を確認します。

プロトコル

>1. iPS細胞由来ニューロンの電気生理学的記録

1. ヒトiPS細胞が成熟したニューロンのように振る舞うか確認します。
   1. 60X(0.9NA)水浸レンズを搭載した正立共焦点顕微鏡を用いてtdTomatoを可視化し、ヒトiPS細胞から分化した細胞を探る。
   2. 記録ピペットを4〜6Mの抵抗に引っ張ります。 95%O₂/5%CO₂で絶えず泡立った外部溶液中の室温で細胞をPerfuseします。記録マイクロピペットに内部溶液を入れます。
   3. 全細胞モードでtdTomato+細胞にパッチを適用し、電流クランプでの電流注入(1秒持続時間、10pA刻み)に応答して活動電位の発火を記録します。
2. ChR2を発現する皮質細胞の活動電位が光刺激によって確実に誘発されるかどうかを確認します。
   1. 共焦点顕微鏡でGFPを可視化することにより、ChR2を発現する皮質細胞を見つけます。皮質細胞に全細胞パッチクランプ記録を行うには、1.1.2から1.1.3の手順で行います。
   2. 活動電位が水銀アークランプ(100 W)による光照明によって確実に誘発されることを確認します。励起フィルターの波長は480/40nmです。
3. 光遺伝学的刺激を行います。
   1. tdTomato+ セルを全セル モードでパッチを適用し、電圧クランプを -70mV に設定します。電流信号を2kHzでフィルタリングし、10kHzでデジタル化します。10 から 20 M の範囲の直列抵抗を監視して、録音中の一貫性を確保します。
   2. 100Wの水銀ランプと480/40nmの励起フィルターで30秒間、フィールド全体を刺激します。
   3. ChR2を発現するシナプス前皮質ニューロンの光刺激によって誘導されたパッチ細胞のシナプス後電流(PSC)を記録します。PSCの検出と測定。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
NaCl	シグマ	S7653
KClの	シグマ	P5405
NaHCO3	シグマ	S5761
NaH2PO4	フルーカ	71505
MgCl2	シグマ	M8266
CaCl2	シグマ	C1016
D(+)-グルコース	シグマ	G7520	電気生理学的研究用
K-グルコン酸	シグマ	P1847
島	関東化学工業	3234400
ヘープス	シグマ	H3375-J	電気生理学的研究用
エグタ	シグマ	E3889
Na2ATP	シグマ	A7699 さん
ナ3GTP	シグマ	G8877
ホウケイ酸ガラスキャピラリー	ワールド精密機器株式会社	1604323
水銀ショートアークランプ	オスラム	HBO 103 W / 2