シナプス共培養における腹側海馬軸索に沿ったニコチン誘発性カルシウムシグナル伝達のイメージング

要約

出典:Zhong, C., et al., 腹側海馬軸索に沿ったニコチン誘導カルシウムシグナル伝達と神経伝達物質放出のライブイメージング。 J. Vis. Exp. (2015年)

このビデオは、マウス腹側海馬におけるニコチン性アセチルコリン受容体のニコチン媒介活性化が、軸索に沿った持続的なカルシウムシグナル伝達をもたらす方法を示しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. カルシウムイメージング

1. 通常のHBSで培養物(in vitroで5〜7日)を迅速にすすぎ、次に5 μM Fluo-4 Ca²⁺インジケーター(AMエステル)と0.02%プルロニックF-127をHBS(2 ml)に37°Cおよび5%CO₂で30分間ロードします。
2. Fluo-4溶液をHBSで洗い流します(3回/ 5分)。培養物をインキュベーター(37°C/5%CO₂)に少なくとも30分間戻します。
3. イメージングチャンバー内で培養物(in vitroで5〜7日)を維持し、チャンバーをスピニングディスク共焦点顕微鏡に取り付けます。RTでHBSカクテルと連続的に灌流(1 ml /分)します。
4. プランアポクロマート対物レンズ(60倍水、1.4 NA、励起488 nm、発光530 nm)とCCDカメラを使用して、vHippマイクロスライスから軸索投影のFluo-4蛍光画像を収集します。
5. ベースラインのFluo-4蛍光画像(10秒ごとに2分間)をプレニコチンコントロールとして収集します。ニコチン(1 μM)を急速灌流(2 mL/分)で1分間塗布し、ニコチンをHBSカクテルで洗います。ニコチン塗布前、投与中、投与後、10秒ごとに30分間タイムラプス画像を撮影し続けます。
6. 生のfluo-4蛍光画像のすべてのフレームを保存し、それらを一連のTIFF画像としてエクスポートして、さらに分析します。
7. ニコチン適用の前後に、vHipp軸索に沿ったfluo-4蛍光の積分強度を収集します。
8. ΔF/F₀ = (F-F₀)/F₀、ここで F₀ はバックグラウンド補正されたニコチン前積分蛍光強度、F はニコチン適用後の各時点における vHipp 軸索に沿った積分蛍光強度です。正規化された積分蛍光強度を解析し、プロットします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HBSカクテル(ライブイメージング用) pH=7.3
NaCl	シグマ	S9888	135 mM
KClの	シグマ	P9333型	5メートルメートル
塩化マグネシウム	シグマ	M8266	1 mM
塩化カルシウム	シグマ	C1016	2 mM
ヘープス	シグマ	H3375-J	10 mM
グルコース	シグマ	G0350500	10 mM
テトロドトキシン	トクリス	1078	2 μM
バイキュクリン	トクリス	131	10 μM
D-AP-5	トクリス	105	50 μM
CNQXの	トクリス	1045	20 μM
LY341495	トクリス	1209	10 μM

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