外科的除神経マウスモデルにおける感覚神経機能の試験

Abstract

出典:Peterson, S. C. et al., Cutaneous Surgical Denervation: A Method for Testing the Requirement for Nerves in Mouse Models of Skin Disease. J. Vis. Exp. (2016)

このビデオは、マウスモデルで片方の側を外科的に除神経し、もう片方をコントロールとして残すことで感覚神経機能をテストする方法を示しています。機械的刺激に対する応答は、感覚神経の役割を裏付けています。

Protocol

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 外科的除神経

1. 麻酔薬溶液をマウス体重20gあたり200μlの用量で腹腔内に注射します。動物がつま先のピンチアッセイによって適切な鎮静面に達したことを確認し、心拍数と呼吸数が正常であることを確認します(それぞれ毎分約600回の拍動と160回の呼吸)。
2. ベタジンとアルコールワイプを使用して背中の皮膚の手術領域を準備し、動物を滅菌外科用ドレープで覆います (デモンストレーションのために、視認性を高めるために滅菌ドレープは省略されています)。 無菌手術エリアで手術している間、加熱パッドを使用して動物を暖かく保ちます。
3. 滅菌済みの#11メスを使用して、首の付け根から尾の約0.5cm上まで背側の正中線に沿って切開します。
4. 鈍い鉗子を使用して、脇腹から離れて左側の皮膚を優しく反射し、首の近くの肩甲骨脂肪パッドから後肢のすぐ上まで、その下にある組織を視覚化します><。 手記： 背側皮膚神経は、胴体壁の半透明の筋膜を尾側に移動する白いストランドとして現れ、その後、鋭く曲がり、皮膚の下の緩い結合組織に入ります(図1)。
5. 解剖光学顕微鏡下で超微細鉗子を使用して、解剖学的部位T3-12に位置する動物の左側から、体幹壁でセグメントが曲がる部分から皮膚への侵入部位まで摘み取ることにより、神経のみを取り除きます(図1)。
   1. 鉗子を垂直に向け、屈曲部位の約0.5cm下をつかんで上に引っ張ることで神経を取り除き、神経を伸ばして周囲の組織から分離させます(図1C-E)。隣接する血管が破裂しないように注意してください。
   2. 体幹壁から皮膚に伸びるすべての神経が取り除かれるまで続けます。体幹壁の密集した筋膜内の神経を乱さないでください。滅菌0.9%生理食塩水を定期的に滴下することにより、手順全体を通して組織を湿らせてください。.
   3. あるいは、鉗子で体幹壁近くの近位端をつかみ、細かいハサミで切り取って神経を取り除きます。その後、皮膚付近の遠位端を切断します(図1F-H)。最後に、介在する神経セグメントを切除します(図1I)。
6. ステップ1.4で露出した皮膚フラップから神経をすべて取り除きます。これらの線維は、背側皮膚神経の遠位枝を構成し、皮膚フラップの真皮側の結合組織内に散発的に位置する白い分岐鎖として現れます(図1J-K)。
   1. これらの細い枝を取り除くには、細い鉗子を真皮表面とほぼ平行に配置し、神経をつかんで上向きに摘み取り、血管の破壊や皮膚の穿刺を防ぎます。目に見える神経がすべて取り除かれるまで続けます。
7. 鈍的解剖を使用して、背側正中線切開の右側に皮膚を反射しますが、神経は取り除かないでください。これは、対側偽の運用コントロールとして機能します。
8. 背側正中線に沿って縫合し、6-0ナイロン縫合糸を使用して切開を閉じるための単純な中断パターンで、約3mm間隔の単純な中断パターンで縫合します。
9. 手術を受けたマウスは、完全に回復するまで他の動物と同じケージに戻さないでください。
10. 手術直後から動物が意識を取り戻すまで、また手術部位が治癒するまで(通常は1週間以内)毎日監視します。指定された施設の動物管理およびマウスが痛みや苦痛の兆候を示した場合は使用ガイドラインに従って鎮痛薬を使用してください。.手術後7〜10日以内に縫合糸を抜去します。手記：必要に応じて、カルプロフェン (50 mg/ml ストック溶液) を滅菌水で 1:100 に希釈して鎮痛液を調製します。この溶液を首筋近くの肩甲骨の間に、体重 20 g あたり 200 μl (マウス体重 5 mg/kg
) で皮下注射します。
11. 手術後数週間までの安定した除神経を機能的に評価するには、電動クリッパーを使用して背側の皮膚から毛を取り除きます。
12. 皮下注射針を使用して除神経された皮膚領域をそっと刺し、動物が通常、身震いしたり頭を回したりして反応するかどうかを記録します。皮膚領域が安定して除神経されている場合、動物はほとんどまたはまったく反応を示しません。

Results

図 1.背側の皮膚を除神経するための2つのアプローチ。(A)神経支配マウスの皮膚の漫画図。赤い点線は、背側正中線に沿って行われた単一の切除を示し、体幹壁(紫)の下にある筋肉組織と、反射した皮膚の下の真皮(灰色、アスタリスク)を露出させます。尾側に移動する背側の皮膚神経は、体幹の壁を離れるときに「曲がる」ように見えます(黒い矢印はそのような曲がりの1つを示しています)。切除する神経セグメントは、黒い点線で区切られています。(B)曲がった部位が示されている無傷の神経の写真(矢印)。青い矢印は、切除される2つの神経セグメントを指しています。(C-D)除神経技術を示す写真。極細鉗子を使用して、神経を曲げる部位の0.5cm下につかみ、外側に引き抜きます。(E)2つの神経セグメントを切除した後の体腔を示す写真(青い矢印)。残りの神経も取り除く必要があります。(F-I)神経除去の代替アプローチが描かれて...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
アルコール準備パッド	PDIの	B339
AnaSed(キシラジン)	ロイド	NADA 139-236
ベタジン調製パッド	メドライン	MDS093917
カルプロフェン(リマジル)	ゾエティス
コードレス充電式クリッパー	ヴァール	トリマーモデル8900
6-0ナイロン縫合糸	デメテック	NL166012F4P
超極細鉗子	デュモン	0103-5-PO