ショウジョウバエの光受容体における長期にわたる脱分極性残電位(PDA)の調査

要約

出典:Gutorov, R., et al. ショウジョウバエの光受容体における光色素レベルを測定するための電気生理学的方法。J. Vis. Exp.(2022年)。

このビデオは、メジロショウジョウバエの長期にわたる脱分極後電位(PDA)を調査するための実験プロトコルを示しています。ハエの目は、光色素ロドプシンをメタロドプシンに変換するために強い青色光パルスにさらされ、陽イオンチャネルを開いて膜脱分極を引き起こすシグナル伝達カスケードを開始します。青色光はメタロドプシンからロドプシンへの再変換を妨げるため、陽イオンの継続的な流入により、長期の脱分極後電位(PDA)として知られる持続的な脱分極が起こります。

プロトコル

1. 網膜電図を用いた長時間の脱分極後電位(PDA)の測定

1. ショウジョウバエのメラノガスター調製に適した飼育条件
   1. Raise D. melanogasterは、24°Cの温度に維持されたインキュベーターで、12時間の暗光サイクルで、標準的なイエローコーンを含む食物を含むボトルで飛んでいます。
   2. 実験の少なくとも24時間前にフライボトルを暗闇に保管してください。
2. 一般的なセットアップ
   1. 1 mm x 0.58 mm(O.D x I.D)の繊維充填ホウケイ酸ガラスキャピラリー(図1L、O)を引っ張って、記録ピペットを準備します。ピペットの抵抗は5〜10MΩである必要があります。任意の適切なプーラーを使用することができます。
   2. 2本の銀線をAgCl₂でコーティングし、0.25mmの銀線をカスタムメイドの5V電源に接続された3M KCl溶液に挿入します。
   3. コーティングされた各銀線を電極ホルダーに挿入します(図1N)。
   4. ガラスキャピラリーにろ過されたリンガー溶液(表1を参照)を細長いチップシリンジ(図1M)で満たします。
   5. ワイヤー電極をガラスキャピラリーに挿入します。キャピラリー内の溶液が銀線に接触していることを確認します。
   6. 電極ホルダー(図2P、N)を2つの電極マイクロマニピュレーター(図2G)に挿入します。
3. 電気録音用のフライを準備する手順
   注意: フライを暗順応した状態に保つには、次の手順では薄暗い赤色光の照明のみを使用してください。
   1. フライスリーパーシステム(図1A、B)を使用してボトル内のハエを_CO2ガスで麻酔し、スリーパーコンテナに注ぎます。
   2. フライを1つ選び、鋭利なピンセットを使用して翼を慎重に保持します。残りのハエをペトリ皿で覆います。
   3. フライをフライホルダーに適切な向きで置きます-仰向けで、背を向けて横になります(図1P)。
   4. はんだごての電源をONにします。電流を~2.25Aに設定します。この電流により、0.25 mm のプラチナ-イリジウム フィラメントが ~55-56 °C に加熱されます。
   5. はんだごてに低融点(~55-56°C)のワックスを一滴垂らします(図1F)。
   6. ピンセットを使用して、フライを翼から持ち上げ、はんだごてを使用して翼をフライホルダー(図1I)に固定します。
   7. はんだごてを使用して、フライの背面をワックスでスタンド面に接続します(図1P)。
   8. はんだごての先端を脚の接合点に下げ、ワックスを溶かしてすべての脚を覆います(図1P)。
   9. 首の部分の頭と背中の間にワックスを少し垂らします(図1P).
      注意: フライヘッドが過熱しないように特に注意してください。ハエが適切に固定され、実験中に動かないことを確認してください。小さな動きは、録音にアーティファクトを作成する場合があります。胸部と腹部の気管開口部(呼吸入口)がワックスで覆われていないことを確認してください。
   10. フライホルダー(図2Q)をマグネットブロック(図2I)の暗いファラデーケージに置き、フライがライトガイドの端から~5mm(図2L)にあることを確認します。
   11. マイクロマニピュレータを使用して、記録電極(図2P)をハエの目の上に配置し、接地電極(図2N)をハエの背中の上部に配置します。
   12. マイクロマニピュレータを使用して、接地電極をフライの背面に挿入します。
   13. 記録電極をハエの目の外周に、好ましくはマイクロマニピュレータを使用して挿入します
       手記：電極を目に挿入した後、小さなくぼみが観察されます。ディンプルが消えるまで、電極を目から取り出さずに上に引っ張ります。電極は、胴体と目に適用される電極ゼリーの小さな液滴に浸すこともできます。
4. PDAプロトコル(このプロトコルはメジロバエでのみ実行できます)
   1. オレンジフィルター(590エッジフィルター、最大光顔料をR状態に変換するため)を使用して、最大強度の5秒の光パルスを与えます。
   2. オレンジフィルターを広帯域ブルー(BP450/40 nm)フィルターに交換し、最大強度で5秒の光パルスを3回与えます
      注:定常状態の電圧応答に達するまで、長く連続した最大強度の青色光パルスを与えることも可能です。
   3. 暗闇で60秒待ち、青色のフィルターを前のオレンジ色のフィルターに交換し、60秒間隔で5秒の光パルスを2回与えます。

表1:リンガーの溶液の組成

の 名 名

Ringerのソリューション
試薬	濃度(mM)
NaCl	130
KClの	2
MgCl2	5
CaCl2	2
ヘープス	10
NaOHおよびHClを使用した7.15へのpH滴定

結果

図1:フライの固定とピペットの準備の記録に必要なツールとデバイス。 (A)フライスリーパーシステム。(B)フライスリーパーシステムペダル。(C)冷光源;(D)実体顕微鏡。(E)ワックスフィラメントヒーター;(F)はんだごて;(G)ワックスフィラメントヒーターペダル;(H)粗いピンセット。(I)磁気フライスタンド;(J)低融点ワックス;(K)デリケートワイプ;(L)垂直ピペットプーラー;(M)先端が細長いシリンジ。(N)電極ホルダー;(o)ホウケイ酸ガラス毛細血管。(P)固定フライ。

図 2: ERG セットアップの概...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細長い先端付き1 mLシリンジ			図1M
粗いピンセット 1		デュモン#5、スタンダード	0.1 mm x 0.06 mm、長さ 110 mm、Inox (図 1H)
2つのコンデンサーレンズ
A/Dコンバーター	分子デバイス	デジデータ1200	代替可能:分子デバイス(例:1440A)からの任意のdigidata - 図2C
増幅器	ほぼ完璧な電子機器		交換可能:ワーナーインスツルメンツ-IE251AまたはIE-210(ヘッドステージ付属)-フィギュア2D
防振テーブル	ニューポート	フォルクスワーゲン-3036-OPT-01	図7H
毛細血管	ハーバード大学装置	ホウケイ酸ガラスキャピラリー	1 mm x 0.58 mm (図 1O)
クランペックス	分子デバイス		ソフトウェア
CO2タンク
冷光源	ショット	KL1500液晶	図1C
繊細なワイパー	キムテック		キムワイプ (図 1K)
電極ホルダー			キャピラリー外径1mm(図1N、図2N、および図2P)に適しています
ファラデーケージ	自家製		電磁ノイズシールドと黒のフロントカーテン(図2K)
フィルター(カラー)	ショット	OG590、エッジフィルター	図2S
フィルター(カラー)	ショット	BP450/40 nm	図2S
フィルター(カラー)	ブレザー	550 nm	図2S
冷光源用フィルター(カラー)	ショット	RG630	図1C
フィルター(熱)	ショット	KG3	図1S
フィルター(減光フィルター)	彩度	6、5、4、3、2、1、0.5、0.3	図2S
フラッシュランプシステム	ハネウェル		図2U
インジェクター付きフライスリーパーシステム	インジェクション + マチック		図1A-B
ランプ電源	PTIの	LPS-220	図2W
光検出器	自家製		フォトトランジスタ(図2O)
ライトガイド			直径3 mm、長さ1.3 m(図2L、M)
光源			高圧オゾンフリー75Wキセノンランプ(50Wで動作)、交換可能:Cairn research-OptoLED(図7R)
低温溶融ワックス	自家製		蜜蝋(Tm≈62°C)とパラフィンを~3:1で混合して、~55〜56°Cの融解温度に到達します(図6J)
ハエ用マグネットスタンド	自家製		図1Iおよび図2Q
ヘッドステージ付き微小電極プリアンプシステム	ほぼ完璧な電子機器		インピーダンステスタ(図2G)
マイクロマニピュレーター(機械式粗い)	トライテックリサーチ 成重	M-2
マイクロマニピュレーター(機械式微粉)	ライツマイクロシステムズ	ライツメカニカルマイクロマニピュレーター	図2F
pクランプ	分子デバイス		ソフトウェア
ペトリ皿			60ミリメートル
パルス発電機	AMPIの	マスター8	図2A
心電図用のReduxクリーム	パーカーラボラトリーズ	Redux電解質クリーム
シャッタードライバー	ユニブリッツ、ヴィンセントアソシエイツ	VCM-D1 シングルチャンネル (単安定	図2V
シャッターシステム	ユニブリッツ、ヴィンセントアソシエイツ	LS2 2mm単安定シャッター	図2V
シルバーワイヤー	ワーナー・インストゥルメンツ		直径0.25〜1 mm、塩素化する必要があります
白金-イリジウムフィラメントで構成されたはんだごて			直径0.25mm(図2F)
立体ズーム顕微鏡	ニコン	SMZ-2Bの	図1D
立体ズーム顕微鏡	野生	ワイルドM5	6、12、25、50の倍率設定(図2E)
シリンジフィルター	ミッレクス		22 μm PVDF フィルター
縦型ピペットプーラー	サッター/成茂	モデルP-97/PP-830	必要に応じて、垂直または水平のプーラーを使用します(図1L)
ワックスフィラメントヒーター	自家製		図1E-G
キセノンフラッシュランプシステム	ラップ博士オプトエレクトロニクス	JML-C2	図2X

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