扁桃体脳スライスにおけるニューロン経路の可視化とマッピング

要約

出典:Bosch, D., et al. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (2016).

このビデオは、マウスの急性扁桃体脳スライスを使用して、内側前頭前皮質(mPFC)と扁桃体ニューロンとの間のシナプス接続を解析する手順を示しています。これらのマウスのmPFCニューロンは、蛍光タンパク質に融合したチャネルロドプシンを発現します。チャネルロドプシンは、光の活性化により、mPFCニューロンにおけるイオン流入と活動電位の生成を促進します。その結果、mPFCニューロンは、シナプス後扁桃体ニューロンに結合する神経伝達物質を放出し、シナプス後電流をトリガーして、mPFCと扁桃体の接続性を視覚化するために記録されます。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. シナプス前線維の可視化と刺激

1. 繊維および細胞の光遺伝学的活性化のためのパッチ顕微鏡を調製します。
   1. 取り付けられた発光ダイオード(LED)を光伝送経路の中央に配置します。
   2. 470nmの適切な波長を選択するパワーメーターを使用して、後焦点面と各対物レンズの出力でのLED光強度を測定します。
   3. 光強度をmW/mm²で計算し、470 nmの波長で測定した値について、各対物レンズの検量線(LED強度(%)対光出力(mW/mm²))を作成します。
2. 界面チャンバーから急性扁桃体スライスを取り出し、蛍光灯を装備した直立顕微鏡に取り付けられたスライスチャンバーに入れます。インターフェースチャンバーで上向きのスライス面が記録チャンバーでも上向きになるようにスライスを配置するように注意してください。~31 °C の温度で 1 - 2 ml/分の速度で、新鮮な酸素化された人工脳脊髄液 (ACSF) でスライスを灌流します。
3. 蛍光灯と発現する特定の蛍光タンパク質に適したフィルターセットを組み合わせて、スライス中のシナプス前繊維を観察します。概要を取得するには5倍対物レンズを使用し(図1E)、ターゲット領域内の繊維密度の評価には60倍対物レンズを使用します.
   注:GFPおよびYFPの場合は、材料/機器の表に指定されているように、フィルターセット「赤」(励起560/40、ビームスプリッター585、発光630/70)のmCherryには、フィルターセット「緑」(励起472/20、ビームスプリッター495、発光490 LP)を使用してください。
4. 実験に必要な範囲で、顕微鏡の光路の開口部を開くか制限します(図2D)。
5. パッチ記録を取得するには、パッチピペットに内部溶液を充填し、電極ホルダーに取り付けます。パッチピペットに陽圧を加え、最初にゆっくりと浴液に下げ、次にマイクロマニピュレーターを使用して視覚的に制御しながらスライスに下げます。
   1. パッチピペットで目的のニューロンに側面と上部からアプローチします。ピペットが細胞の表面にあるとき(細胞表面にくぼみが見える)で陽圧を放し、負圧を加えることで「ギガシール」を得ます。
   2. さらに吸引力を加えてメンブレンパッチを破裂させ、全細胞記録を取得します。その後、チャネルロドプシン(ChR)(470nm)を活性化するための適切な波長を使用して、接続されたLEDで標識されたファイバーを刺激し、細胞からの電気的応答を記録します。
   3. シナプス刺激の場合は、低いLED強度から始めて、目的のシナプス電流振幅に達するまで増やします。データ・アクイジション・ソフトウェアでデジタル出力を構成してLEDをトリガし、タイミングとパルス長を制御します(図3の例).
      注:他のソフトウェアやTTL生成デバイスを使用してLEDをトリガーできます。
6. 次に記録された細胞および/または特定の薬物の存在下で、必要に応じて顕微鏡の光路で開口または制限された開口部(ステップ1.4)で刺激を繰り返します。

結果

図 1.定位注射、急性脳切片の調製、シナプス前線維の可視化。(A、B)定位ウイルス注射。A) 頭蓋骨を露出させた状態で定位フレームに麻酔をかけたマウスと注射ピペットの写真。挿入図:ウイルス溶液とファストグリーンを混ぜた注入ピペットの写真を拡大します。スケールバー:3mm.(B)マウスの頭蓋骨の概略図で、さまざまな注入領域のドリル穴の位置がマークされています。(C)この研究で使用されたさまざまなウイルスコンストラクトを示すスキーム。ダークグレー:プロモーター配列;青:チャネルロドプシン2(ChR2(H134R));緑/赤:蛍光タンパク質。発現時間は、局所扁桃体投影で2週間、mPFCおよびMGm/PINからの投影で4〜6週間でした。(D)急性脳スライスの調製:異なる...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
人工脳脊髄液(ACSF)	構成については、参考文献#16および#23を参照してください
内部パッチソリューション	構成については、参考文献#16および#23を参照してください
硫酸マグネシウム七水和物	Roth, ドイツ	P027.1	精製水で2Mストック溶液を調製します
ステレオスコープ、SZX2-RFA16	オリンパス(日本)
Xcite蛍光灯(XI120Q-1492)	Lumen Dynamics Group、カナダ	2012-12699
パッチマイクロスコープ BX51WI	オリンパス(日本)
マルチクランプ700Bパッチアンプ	Molecular Devices社(米国)
ディジットデータ 1440A	Molecular Devices社(米国)
PClamp ソフトウェア バージョン 10	Molecular Devices社(米国)		データ取得と刺激の制御に使用
バス温度調節器、TC05	Luigs & Neumann, ドイツ	200-100 500 0145
3軸マイクロマニピュレーター Mini 25	Luigs & Neumann, ドイツ	210-100 000 0010
マイクロマニピュレーターコントローラー SM7	Luigs & Neumann, ドイツ	200-100 900 7311
パッチピペット用ガラスキャピラリー	World Precision Instruments(ドイツ)	GB150F-8Pの
界面チャンバー用硝酸セルロース濾紙	Satorius Stedim Biotech、ドイツ	13006〜50----ACN
LEDユニット、CoolLED pE	CoolLED、英国	244-1400	CoolLEDまたはUSL 70/470と適切なアダプターは、LED刺激の2つの選択肢です
CoolLED 100デュアルアダプト	CoolLED、英国	pEアダプター-50E
LEDユニット、USL 70/470	ラップオプトエレクトロニクス	L70-000
デュアルポートアダプタ	ラップオプトエレクトロニクス	会社に問い合わせる
フィルターセット赤(励磁)	AHF, ドイツ	F49-560	フィルターはF46-008のセットとして購入できます
(ビームスプリッター)	AHF, ドイツ	F48-585
(エミッション)	AHF, ドイツ	F47-630
フィルターセットグリーン(励磁)	AHF, ドイツ	F39-472	代替案:フィルターセットF36-149またはF46-002(バンドパスエミッション付き)
(ビームスプリッター)	AHF, ドイツ	F43-495W
(エミッション)	AHF, ドイツ	F76-490
LaserCheck、ハンドヘルドパワーメーター	Coherent, アメリカ	1098293
IgorPro ソフトウェア、バージョン 6	Wavemetrics、米国		電気生理学データ解析には、他の代替ソフトウェアパッケージも使用できます
IgorProのニューロマティックマクロスイート	http://www.neuromatic.thinkrandom.com

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