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扁桃体脳スライスにおけるニューロン経路の可視化とマッピング

July 8th, 2025

In This Article

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

出典:Bosch, D., et al. Ex Vivo Optogenetic Dissection of Fear Circuits in Brain Slices. J. Vis. Exp. (2016).

このビデオは、マウスの急性扁桃体脳スライスを使用して、内側前頭前皮質(mPFC)と扁桃体ニューロンとの間のシナプス接続を解析する手順を示しています。これらのマウスのmPFCニューロンは、蛍光タンパク質に融合したチャネルロドプシンを発現します。チャネルロドプシンは、光の活性化により、mPFCニューロンにおけるイオン流入と活動電位の生成を促進します。その結果、mPFCニューロンは、シナプス後扁桃体ニューロンに結合する神経伝達物質を放出し、シナプス後電流をトリガーして、mPFCと扁桃体の接続性を視覚化するために記録されます。

Protocol

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動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. シナプス前線維の可視化と刺激

  1. 繊維および細胞の光遺伝学的活性化のためのパッチ顕微鏡を調製します。
    1. 取り付けられた発光ダイオード(LED)を光伝送経路の中央に配置します。
    2. 470nmの適切な波長を選択するパワーメーターを使用して、後焦点面と各対物レンズの出力でのLED光強度を測定します。
    3. 光強度をmW/mm2で計算し、470 nmの波長で測定した値について、各対物レンズの検量線(LED強度(%)対光出力(mW/mm2))を作成します。
  2. 界面チャンバーから急性扁桃体スライスを取り出し、蛍光灯を装備した直立顕微鏡に取り付けられたスライスチャンバーに入れます。インターフェースチャンバーで上向きのスライス面が記録チャンバーでも上向きになるようにスライスを配置するように注意してください。~31 °C の温度で 1 - 2 ml/分の速度で、新鮮な酸素化された人工脳脊髄液 (ACSF) でスライスを灌流します。
  3. 蛍光灯と発現する特定の蛍光タンパク質に適したフィルターセットを組み合わせて、スライス中のシナプス前繊維を観察します。概要を取得するには5倍対物レン....

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Results

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図 1.定位注射、急性脳切片の調製、シナプス前線維の可視化。(A、B)定位ウイルス注射。A) 頭蓋骨を露出させた状態で定位フレームに麻酔をかけたマウスと注射ピペットの写真。挿入図:ウイルス溶液とファストグリーンを混ぜた注入ピペットの写真を拡大します。スケールバー:3mm.(B)マウスの頭蓋骨の概略図で、さまざまな注入領域のドリル穴の位置がマークされています。(C)この研究で使用されたさまざまなウイルスコンストラクトを示すスキーム。ダークグレー:プロモーター配列;青:チャネルロドプシン2(ChR2(H134R));緑/赤:蛍光タンパク質。発現時間は、局所扁桃体投影で2週間、mPFCおよびMGm/PINからの投影で4〜6週間でした。(D)急性脳スライスの調製:異なる.......

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Disclosures

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利益相反は宣言されていません。

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
人工脳脊髄液(ACSF)構成については、参考文献#16および#23を参照してください
内部パッチソリューション構成については、参考文献#16および#23を参照してください
硫酸マグネシウム七水和物Roth, ドイツP027.1精製水で2Mストック溶液を調製します
ステレオスコープ、SZX2-RFA16オリンパス(日本)
Xcite蛍光灯(XI120Q-1492)Lumen Dynamics Group、カナダ2012-12699
パッチマイクロスコープ BX51WIオリンパス(日本)
マルチクランプ700BパッチアンプMolecular Devices社(米国)
ディジットデータ 1440AMolecular Devices社(米国)
PClamp ソフトウェア バージョン 10Molecular Devices社(米国)データ取得と刺激の制御に使用
バス温度調節器、TC05Luigs & Neumann, ドイツ200-100 500 0145
3軸マイクロマニピュレーター Mini 25Luigs & Neumann, ドイツ210-100 000 0010
マイクロマニピュレーターコントローラー SM7Luigs & Neumann, ドイツ200-100 900 7311
パッチピペット用ガラスキャピラリーWorld Precision Instruments(ドイツ)GB150F-8Pの
界面チャンバー用硝酸セルロース濾紙Satorius Stedim Biotech、ドイツ13006〜50----ACN
LEDユニット、CoolLED pECoolLED、英国244-1400CoolLEDまたはUSL 70/470と適切なアダプターは、LED刺激の2つの選択肢です
CoolLED 100デュアルアダプトCoolLED、英国pEアダプター-50E
LEDユニット、USL 70/470ラップオプトエレクトロニクスL70-000
デュアルポートアダプタラップオプトエレクトロニクス会社に問い合わせる
フィルターセット赤(励磁)AHF, ドイツF49-560フィルターはF46-008のセットとして購入できます
(ビームスプリッター)AHF, ドイツF48-585
(エミッション)AHF, ドイツF47-630
フィルターセットグリーン(励磁)AHF, ドイツF39-472代替案:フィルターセットF36-149またはF46-002(バンドパスエミッション付き)
(ビームスプリッター)AHF, ドイツF43-495W
(エミッション)AHF, ドイツF76-490
LaserCheck、ハンドヘルドパワーメーターCoherent, アメリカ1098293
IgorPro ソフトウェア、バージョン 6Wavemetrics、米国電気生理学データ解析には、他の代替ソフトウェアパッケージも使用できます
IgorProのニューロマティックマクロスイートhttp://www.neuromatic.thinkrandom.com
。 。

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