ラットにおける網膜電図と視覚誘発電位の記録

要約

出典:Charng, J. et al. 意識のあるラットにおけるワイヤレス網膜電図と視覚誘発電位の移植と記録。J. Vis. Exp. (2016).

このビデオでは、意識のあるラットで網膜電図(ERG)と視覚誘発電位(VEP)を記録する方法を示します。外科的に電極を埋め込んだラットは、最初に暗順応します。拡張液滴を適用した後、動物を拘束具に入れ、ガンツフェルドボウルに配置します。その後、ERG信号とVEP信号が記録されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 電極の準備

注: 外科的移植には3チャンネルの送信機が使用され、2つの網膜電図(ERG)と1つの視覚誘発電位(VEP)の記録を同時に行うことができます。3つのアクティブ電極と3つの非アクティブ電極は、眼に取り付けるために、移植前にリング状に事前に形成する必要があります。識別のために、メーカーはアクティブ電極を半分白、半分色のプラスチックシースで封じ込め、非アクティブ電極はフルカラーのシースで覆っています。接地電極(透明なプラスチックシース)は、ステップ1.1、1.2、1.3、および1.7を実行するために、すべてのアクティブ電極と非アクティブ電極に対して変更されずに残されます。

1. 2本の細い先端のペンチで、2本のより線状のステンレス鋼電極をほどきます。
2. ステンレス製のストランドの1つ(先端から約1cm)をトリミングし、リング電極を成形するための長い直線ストランドを1本残します。
3. 1本のステンレス鋼ストランドを折り返してねじり、電極の先端に滑らかなリングを形成します。
4. ERG活性電極は、ループの基部をねじってこのループを直径0.2 - 0.5 mmに形成し(ここで説明する目的のために、2つの能動電極をこのように成形して両目からのERGを記録する)、ERG非アクティブ電極とVEP電極は、ループ直径~直径0.8 mmにします(この例では、 これは、1つのアクティブVEP電極と3つの非アクティブ電極すべてに対して行います)。
5. 円形のVEPアクティブ電極をステンレス製のネジ(直径0.7 mm、長さ3 mm)に引っ掛けて、電極がネジの頭に当たるようにします。
6. 3つの非アクティブ電極(2 ERG、1 VEP)を2本目のステンレス鋼ネジ(直径0.7 mm、長さ3 mm)に引っ掛けます。
7. プラスチックスリーブを2本のステンレス鋼ストランドの鋭い端に引っ張って、刺激を軽減します。
8. テレメトリー送信機を2%グルタルアルデヒドに約25°Cで10時間以上浸して滅菌します。次に、滅菌生理食塩水でトランスミッターを3回すすぎます。

2. 送信機の埋め込み

1. 動物の調理
   1. 実験前に手術部位を70%エタノールで洗浄して消毒します。使用前にすべての手術器具をオートクレーブし、手術中に使用しないときはクロルヘキシジンで器具を保守してください。手術中は動物を手術用ドレープで覆い、無菌環境を維持します。すべての実験者がサージカルマスク、滅菌手袋、ガウンを着用していることを確認してください。
   2. 1.5 - 2% イソフルランを 3 L/min の流量で麻酔を誘発し、手術中は 2 L/min で 1.5 - 2% に維持します。足の指の間に筋肉を挟むときにペダル反射がないことにより、十分な麻酔の深さを確認します。
   3. 腹部の鼠径部の上から胸骨まで40mm×30mmの領域を剃ります。
   4. 額の上、目の後方と耳の前方に30 mm x 20 mmの領域を剃ります。
   5. 剃った2つの部分を消毒します。額の領域については、10%ポビドンヨードで3回消毒します(目の近くの領域にはアルコールベースの消毒剤の使用を避け、外科技術者協会が定めた標準治療基準と一致しています)。腹部全体に、10%ポビドンヨードと70%エタノールで消毒します。.
   6. 追加の局所麻酔のために、1滴のプロキシメタカインを角膜に塗布します。.
   7. カルボキシメチルセルロースナトリウムを角膜に1滴塗布して、目の乾燥を防ぎます。
2. 外科的移植
   1. 外科用メスで耳の間の垂直正中線に沿って頭に10mmの切開を行います。
   2. 胸骨の下の正中線に沿って皮膚層を通して腹部に5mmの切開を行います。
   3. 腹部切開部から頭部切開部まで、直径5mmのカニューレを皮下トンネルで固定します。
   4. 送信機の電極線(3本がアクティブで3本非アクティブ)をカニューレを通して腹部から頭部に送ります。
   5. 参照電極をトランスミッターベースに残し、電極先端を無菌ガーゼで覆います。
   6. 電極の先端(アクティブ3つと非アクティブ3つ)を無菌ガーゼで覆います。
   7. ラットの頭を定位固定装置に固定します。
   8. 手術用ハサミで額の切開部を長さ30mmに伸ばします。
   9. ~3時と9時の2本の縫合糸(3-0)で緩んだ皮膚を引っ込めて手術部位を露出させます。
   10. 滅菌したガーゼを使用して頭蓋骨を覆う骨膜をこすり落とし、ブレグマ、ラムダ、正中線縫合糸を露出させます。
   11. VEPアクティブ(腹側からブレグマまで7mm、側方から正中線まで3mm)と非アクティブ(正中線上の吻側からブレグマまで5mm)の定位固定座標で頭蓋骨に2つの穴を開けます。
   12. VEPのアクティブ電極と非アクティブ電極を、あらかじめ取り付けられたステンレス製のネジ(直径0.7mm、長さ3mm)で頭蓋骨に小さなドライバーで~1mmの深さまで事前に作られた穴に取り付けます。これにより、下にある皮質組織に損傷を与えることなく、ネジを骨に固定します。
   13. ERGアクティブ電極を埋め込むには、8-0縫合糸を使用して上まぶたを一時的に引っ込めます。
   14. 16〜21Gのカニューレを目の後ろから上結膜円蓋まで皮下に挿入します。
   15. ガイド針を取り外します。
   16. 額から目に向かって、短くなったプラスチックカテーテルを通して能動電極を送ります。次に、プラスチックカテーテルを取り外します。
   17. 電極ループに通された一時的な縫合糸(8-0)を使用して、電極がトンネルに戻るのを防ぎます。
   18. 12時位置の上結膜を0.5mm切開し、輪部から1mm後ろに切り込みを入れます。鈍的解剖を使用して、下にある強膜を露出させます。
   19. 8 - 0 または 9 - 0 の縫合糸を、強膜の厚さの半分でリンバスのすぐ後ろに埋め込みます。
   20. ERGアクティブ電極から一時的な縫合糸を取り外してください。
   21. ERGアクティブ電極を3つの連続した結び目で半分の強膜厚縫合糸に固定し、電極の先端がリンバスの近くに位置するようにします。
   22. 1〜2本の中断縫合糸(8-0〜9-0)を使用して結膜フラップを閉じます。.結膜がERG電極を完全に覆っていることを確認して、快適性を向上させます。
   23. まぶたの引き込み縫合糸を取り外します。
   24. 反対側の目についても手順を繰り返します。
   25. 頭蓋骨にシアノアクリレートゲルを塗布して、すべてのステンレス製のネジと電極線を固定します。ERGアクティブ電極を固定する前に、ERGアクティブ電極がきつく引っ張られすぎていないことを確認してください。
   26. 非吸収性の3-0縫合糸を使用して頭部の傷を閉じます。
   27. げっ歯類を回転させて腹部を露出させます。手術用ハサミで腹部の真皮切開をLinea albaに沿って40mmに延長します。
   28. 内側の筋肉壁を35mm切開して、内側の腹腔を露出させます。
   29. 2つの縫合糸(3-0)を使用して、送信機本体を動物の右側の内腹壁に取り付けます。肝臓に接触しないでください。
   30. 接地電極をループし、縫合糸(3-0)でこの形状に固定します。その後、腹腔内に浮かべて置きます。
   31. 連続縫合糸(3-0)を使用して腹膜を閉じます。
   32. 中断された縫合糸(3-0)を使用して皮膚切開を閉じます。
3. 術後のケア
   1. 動物が胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を監視します。.手術後、動物を一人で飼います。
   2. 鎮痛のためにカルプロフェン(5 mg / kg)を1日1回4日間皮下投与します。.
   3. 予防的経口抗生物質(エンロフロキシン、5 mg / kg)を手術後7日間飲料水に加えます。.
   4. 皮膚切開部位に抗炎症軟膏を塗布して、手術後最初の7日間の刺激を軽減します。

3. 意識のあるラットでのERGおよびVEP録音の実施

1. ERGおよびVEP記録の12時間前に動物を暗く適応させます。
2. すべての実験操作は、薄暗い赤色の照明下(17.4 cd.m-2、λmax = 600 nm)
3. 局所麻酔(0.5%プロキシメタカイン)および拡張(0.5%トロピカミド)滴を角膜に適用します。.
4. 意識のあるげっ歯類をカスタムメイドの透明な拘束具に導きます。
   注:このプラスチックチューブの長さは、全体の直径が60mmに固定されており、さまざまなサイズのラットに合わせて調整できます。デバイスのフロントエンドは、頭の動きを最小限に抑えるために先細りになっており、通常の呼吸を可能にするためのミシン目が含まれています。この先細りのフロントは、ラットの頭と目をガンツフェルト球の開口部に位置合わせし、安定させることができます。げっ歯類は手術前に拘束具に順応していることに注意してください(3〜5回)。
5. げっ歯類をガンツフェルドボウルの前に置き、目をボウルの開口部に合わせます。
6. 留置送信機から~5cm以内に磁石を通して電源を入れます。次に、受信機ベースのLEDステータスライトを確認して、送信機がオンになっていることを確認します。
7. 光エネルギーの範囲 (例: -5.6 から 1.52 log cd.s.m² ) で信号を収集します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
バイオアンプ	ADInstruments	ML 135	ERGおよびVEP信号を増幅
カルボキシメチルセルロースナトリウム1.0%	アラガン	CASの0009000-11-7	手術中に角膜の水分補給を維持する
カルプロフェン 0.5%	ファイザー・アニマルヘルス・グループ	CASの53716-49-7	術後鎮痛、体液補給のための注射生理食塩水による投与
クロルヘキサジン0.5%	オリオン研究所	27411、80085	手術器具の消毒
シアノアクリレートゲル活性化剤	RSコンポーネンツ	473-439	シアノアクリレートゲルを素早く乾燥させます
シアノクリレートゲル	RSコンポーネンツ	473-423	ステンレス製ネジを頭蓋骨に固定する
歯科用バリ	ストルツ・インスツルメンツ社、ボシュ・ロム	E0824A型	直径~0.7mmのミニチュアドリルヘッドで、各半球の頭蓋骨に小さな穴を開けてVEPネジを埋め込みます
ドリル	ボッシュ	ドレメル300シリーズ	トレパニング用自動ドリル
エンロフロキシン	トロイ研究所		予防的抗生物質の手術後
ガンツフェルド積分球	フォトメトリック・ソリューションズ・インターナショナル		カスタム設計の光刺激装置:直径36 mm、開口部サイズ13 cm
ガーゼ綿棒	マルチゲートメディカルプロダクツPty株式会社	57-100バート	手術中に外科的切開部と露出した頭蓋骨表面を乾燥させます
イソフルラン 99.9%	アボット・オーストラレーシア社	CASの26675-46-7	専有名:イソフロ(TM)吸入麻酔薬。VEP電極インプラント手術用の薬剤用吸入麻酔薬と酸素ガスの混合
ケナコーム軟膏	アスペンファーマPty株式会社		手術後の皮膚の炎症やかゆみを軽減するため
ルクシオンLED	フィリップスライティング株式会社		光刺激には、5ワットのLED20個と1ワットのLED1個、Scopeソフトウェアで制御
ニードル(マクロサージェリー)	世界の精密機器	501959	腹部および頭部手術の縫合用、3-0縫合糸、アイニードル、刃先5/16円サイズ1、15mmで使用
ニードルホルダー(マクロサージェリー)	世界の精密機器	500224	腹部および頭部の手術中に針を保持するため
ニードルホルダー(マイクロサージェリー)	世界の精密機器	555419NTの	眼科手術中に針を保持するため
Optivaカテーテル	スミスメディカルインターナショナル株式会社	16または21 G	頭蓋骨から結膜までの角膜活性電極のガイド
ポビドンヨウ素 10%	サノフィ-アベンティス	CASの25655-41-8	専有名:ベタジン、手術用の剃毛肌を準備する消毒剤10%、500mL
Powerlabデータ収集システム	ADInstruments	ML 785	テレメトリー送信機から信号を取得し、テレメトリーデータコンバーターとペアリング
プロキシメタカイン 0.5%	アルコン研究所	CASの5875-06-9	局所眼痛
拘束具	キュートムメイド		拘束具の前面は頭の動きを最小限に抑えるために先細りになっており、長さはラットの長さに合わせて調整でき、全体の直径は60mmです。
スケーペルブレード	R.G.医療用品	SNSM0206	外科的切開用
ハサミ(マクロサージェリー)	世界の精密機器	501225	腹部と額の組織を切断するため
ハサミ(マイクロサージェリー)	世界の精密機器	501232	電極付着のための結膜を解剖する
スコープソフトウェア	ADInstruments	バージョン 3.7.6	ADI Powerlabシステムを介して刺激をトリガーし、データを収集すると同時に
シェーバー	オスター	ゴールデンA5	手術部位から毛皮を剃る
ステンレス製ストリールネジ	マイクロファスナー	L001.003CS304	シャフト径0.7mm、長さ3mm
脳定位固定装置用フレーム	デビッド・コップフ	モデル900	頭蓋骨の着床ランドマークを特定するための小動物定位固定装置です
外科用ドレープ	バイタルメディカルサプライ	GM29-612EEの	手術中の無菌環境を確保する
縫合糸(マクロサージェリー)	ニンボ医療用針	3-0	腹部および頭部の手術の縫合用、滅菌シルク編み込み、60cm
縫合針(マイクロサージェリー)	ニンボ医療用針	8-0 または 9-0	眼科手術用、強膜への電極縫合、結膜創傷の閉鎖、ナイロン縫合、3/8円 1×5、30cm
テレメトリデータコンバータ	データサイエンスインターナショナル	R08	テレメトリ信号をデータ収集ソフトウェアとインターフェース可能
テレメトリデータ交換マトリクス	データサイエンスインターナショナル		送信機からデータを収集し、受信機とペアリング
テレメトリデータ受信機	データサイエンスインターナショナル	RPC-1	送信機からテレメトリデータを受信し
遠隔測定送信機	データサイエンスインターナショナル	F50-EEEの	3チャンネルテレメトリー送信機
トロピカミド0.5%	アルコン研究所		虹彩拡張
ピンセット(マクロサージェリー)	世界の精密機器	500092	腹部および頭部の手術中に組織を操作する
ピンセット(マイクロサージャリー)	世界の精密機器	500342	眼科手術中に組織を操作する

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