てんかん誘発性ラットにおけるてんかん発作の脳波記録

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. マイクロダイアリシスプローブ電極デバイスの組み立て

1. 3チャンネルの2ツイスト電極(レジスタ電極の切断長が20mm以上、接地電極が10cmの長さ)を使用し、ガイドカニューレに結合してデバイスを準備します。図1A-1Bの透析用3チャンネル電極とガイドカニューレの例を参照してください。
2. 金属製のガイドカニューレを取り外し(図1C)、使用前に数回ダミーのプラスチックカニューレに挿入します(図1D)動物のマイクロダイアリシスプローブのスイッチの瞬間に取り外しを容易にします。
3. レジスタ電極の撚り線を2回曲げ(図1E-1F)、ガイドのダミーカニューレにワイヤーを合わせ、電極先端(図1G)をガイドカニューレの先端(図1H)より0.5mm長くカットします(図1H)。
4. 長さ1mmのシリコンサークレット(外径[O.D.]2 mm、厚さ0.3 mm;図1I)ガイドカニューレの先端とねじれた電極の先端をピンセットを使用してシリコンサークレットに挿入します(図1J)。ガイドカニューレ台座の足に、ラピッドアクションのポリマー接着剤または樹脂で固定します(図1K)。図 1L と図 2A の完成したデバイスの例を参照してください。
5. 殺菌紫外線(UV)光の下でデバイスを4時間滅菌します。デバイスを4回裏返して、各側面が1時間光にさらされるようにします
   手記： 多くの自家製の電極とマイクロダイアリシスプローブは、同様の方法で組み立てることができます。ラット用の上述のインプラントの頭部は、以下の寸法を有する:7mm幅×5mm深さ×上部から台座のつま先までの長さ10mm;インプラントチップの長さは約11mm、直径は600μmで、すべてのデバイスの重量は約330〜360mgです。(i)次の使用のために手術中に十分な長さの接地電極が頭蓋骨に残され、(ii)動物が殺された場合、およびデバイスが歯科用セメントと共に回収され、セメントが機械的に分解され得るようにアセトンで一晩放置される場合、デバイスは2回または3回再利用されてもよい。 そして、デバイスを洗浄して再度滅菌しました。

2. 脳定位固定術

1. 無菌手術と無痛手術の現代的な基準に従ってデバイスを埋め込むには、定位固定装置とプローブクリップホルダー(図2B)を使用します。
   1. 成体のSprague-Dawleyラットにケタミン/キシラジン混合物(43 mg / kgおよび7 mg / kg、腹腔内[i.p.])で麻酔をかけ、定位固定装置フレームに固定します。.イソフルラン麻酔(空気中で1.4%、1.2 mL /分)を最初のケタミン/キシラジン注射に追加して、麻酔の深さを時間内に制御できるようにします。.動物の頭の毛皮を剃ります。
2. ヨウ素ベースの溶液で頭部の皮膚表面を綿棒で拭き、続いて70%エタノールで無菌手術の準備をします。
   1. 優先順位(1.1 – 1.5)で準備されたガイドカニューレ電極デバイスを、次の座標を使用して右腹側海馬に埋め込みます:ノーズバー+ 5.0 mm、A – 3.4 mm、L + 4.5 mm、P + 6.5 mmをブレグマに。定位固定術の標準的な技術に従ってください。
   2. 固定ネジを覆わないようにしてください。定位固定装置に取り付けるときは、ガイドカニューレヘッド用の装置をつかんでください。これはプローブホルダーに簡単に位置合わせできる場合があります。
3. 少なくとも4本のステンレス製ネジで頭蓋骨にデバイスを固定します(左骨プレートに1本、右前頭骨プレートに1本、左頭頂骨プレートに1本、頭頂骨プレートに1本)。ティッシュ接着剤を一滴加えて、各ネジを頭蓋骨にさらに固定します。
   1. ねじ山の半分をメタクリルセメントで覆います。接着力を高めるために骨に浅い溝を作ることにより、セメントの結合を促進します。
4. デバイスの先端が脳組織に配置されたら、接地電極のワイヤーを3本の固定ネジの周りにねじります。取り付けられているすべてのネジとデバイスを歯科用セメントで覆います。
5. 手術中および手術後約1時間、動物が直立してケージの周りを移動するまで、動物を監視します。低体温症を避けるために、温めパッドの上に置いてください。デバイスの移植後、ラットが少なくとも7日間回復するのを待ちます。
6. 手術後3日間は、少なくとも1日1回、動物に痛みや苦痛の兆候がないか監視します。抗生物質クリーム(ゲンタマイシン0.1%)を切開部位の近くに投与して感染を防ぎ、鎮痛剤(トラマドール5 mg / kg、i.p.)を3日間投与して術後の痛みを防ぎます。.

3. ピロカルピンによる側頭葉てんかん誘発と動物実験群への割り当て

1. 術後の回復から1週間後、動物をグループにランダムに割り当てます:(i)ビヒクルを受け取る対照動物と(ii)ピロカルピンを投与されるてんかん動物。てんかん患者群には、ピロカルピンを投与したラットのすべてが病気を発症するわけではないため、比例してより多くの動物を使用してください。.
2. メチルスコポラミン (1 mg/kg、皮下 [s.c.]) を注射し、その 30 分後にピロカルピン (350 mg/kg、i.p.) を 1 回注射しててんかん重積状態 (SE) を誘発します。メチルスコポラミンとビヒクル(生理食塩水)を対照ラットに注射します。すべてのi.p.投与には、25G針付きの1mLシリンジを使用してください。.
   1. 動物を目視で確認して、行動発作(5分以内に振動を動かし、頭をうなずかせ、手足をクローン化する)を開始し、25分以内に全身(SE)を継続的にクローン化します。
3. ジアゼパム(20 mg / kg、i.p.)の投与により、発症から2時間後にSEを停止し、死亡率が約25%、平均潜伏期間が約10日になります。.ピロカルピン注射の直後に始まる発作行動を観察して記録し、その後少なくとも6時間継続します。.
4. 25G針入り1mLシリンジと1mLシリンジを使用したスクロース溶液(1mL、p.o.)を動物に生理食塩水(1mL、i.p.)と1mLシリンジを使用し、SE後2〜3日間17G針を柔軟に給餌して、体重減少の回復を促進します。
   1. ピロカルピンSE後の最初の1週間以内に初期体重を達成しなかった動物を研究から除外します(SEの24時間後に死亡した急性群を除く、体重の追跡が不可能な場合)。
5. SE後の動物を異なる実験群にランダムに割り当てます(図3):急性期(SEの24時間後にマイクロダイアリシスが行われる)、潜伏期(SEの7〜9日後)、最初の自然発作(SEの約11日後)、および慢性期(SEの約22〜24日後、つまり最初の発作の約10日後に開始します)。自然発作の発生について動物を監視します.
   手記： てんかんラットでのさらなる実験には、次の包含/除外基準を使用してください:ピロカルピン投与後1時間以内のけいれん性SEの発症;SE後の最初の週の体重増加と、マイクロダイアリシスプローブと電極の正しい位置決め。

>4. てんかんの行動の監視と分析

1. てんかん行動の長期モニタリング
   1. ピロカルピン投与の約6時間後(すなわち、研究者による直接観察の終了時)、動物を清潔な家庭用ケージに入れ、24時間のビデオモニタリングを開始します。
   2. デジタルビデオ監視システムを使用して、5日目まで24時間のビデオ監視を続けます。
   3. 5日目から、自宅の長方形のケージにいるラットをテザーEEG記録システムに接続し、24時間のビデオモニタリングを続けます。
   4. ファラデーケージの外側に配置されたアンプでパラメータを設定し(各動物のEEG信号の特異性に応じて各チャネルに増幅係数を設定します)、未接続のケーブルによって生成されたEEG信号を観察してEEG取得を開始します。サンプリング レートを 200 Hz にし、ローパス フィルターを 0.5 Hz に設定します。
   5. 片方の手で伸ばした2本の指の間に動物の頭を固定するケーブルに動物を接続し、もう一方の空いている手でコネクタを電極台座にねじ込みます。取得を開始します.
      注意：信号にアーティファクトがないことを確認します。一般的なアーティファクトは、スケールを大幅に超えるスパイクです。
   6. マイクロダイアリシス実験の前日に、マイクロダイアリシス用のプレキシガラスボンベを装備したテザーEEGシステムに動物を移します。動物をホームケージのEEGテザリングシステムから切り離し、動物を拘束せずに電極からコネクタをねじ込みます。動物をハイプレキシガラスシリンダーに入れます。

図 1.埋め込むデバイスの段階的な準備。(A)左側の保護スリーブに長さ10cmの接地電極を備えた3チャンネル電極、右側のマイクロダイアリシス用ガイドカニューレはデバイスの組み立てに必要なものです。(B)むき出しの電極とガイドカニューレの詳細。最初のステップは、金属製のガイドカニューレをプラスチックダミーから数回取り外して挿入(D)し、動物の頭に埋め込まれたカニューレの解放を容易にすることです。2番目のステップは、ねじれたレジスター電極を2倍曲げて透析ガイドカニューレ(E、F)に位置合わせすることです。(G)電極の先端は、金属製のガイドカニューレの先端より0.5mm長くカットする必要があります。(H)デジタルキャリパーを使用してカットの精度を確認します。続いて、長さ約1mmのシリコンサークレットを使用して、カニューレフット(I)をガイドする電極の位置合わせを固定する必要があります。(J)電極のリング方法とカニューレシャフトのガイド方法を示す写真。最後のステップは、シリコンサークレットをガイドカニューレ台座に固定するガイドカニューレ台座に樹脂または接着剤を一滴垂らすことです(K)。(L)滅菌する準備ができている組み立てられたデバイス。

図 2.使用したラットの微小透析EEG用のさまざまなタイプのデバイスの写真(A)と、これらのデバイスを埋め込むために使用されたプローブクリップホルダーの写真(B)。(A)ガイドカニューレ(緑色)は、通常、実験の24時間前にマイクロダイアリシスカニューレに交換されます。デバイスの電気コネクタ(この原稿で説明されている録音には左から使用されています)により、電気信号を伝導するワイヤをアンプおよびデータ収集装置に取り付けることができます。この装置は、麻酔をかけたラットの頭蓋骨に外科的に取り付けられ、自由に行動するラットに痛みや不快感を引き起こすことなく、後で記録を得ることができる。

図 3.実験計画。てんかん重積状態 (SE) 導入の前の週に、ラットにデバイスを移植します。SEはピロカルピンによって誘発され、動物(透析されていない場合、SEの24時間後に死亡した場合、急性群のラット)を5日間ビデオ監視し(青線)、次にビデオEEGを監視して、自宅のケージでの発作の頻度と持続時間を評価します(緑の線)。微小透析実験では、てんかんとそれぞれの非てんかん対照ラットを、微小透析セッションの 24 時間前にシリンダーケージを備えた別の脳波セットに移し、ビデオ脳波を監視します (薄緑色の線)。縦の赤い線は、てんかん疾患の発症のさまざまな時点での透析セッションを表しています。横の赤い線は、てんかん動物(およびそれぞれの非てんかん動物)のさまざまなグループを表し、矢印はマイクロダイアリシスの最終日と動物の死亡日を示しています。