方法論記事

急性海馬切片における神経野興奮性シナプス後電位の記録

2025年7月8日

この記事について

要約

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出典:Weng, W., et al. Recording Synaptic Plasticity in Acute Hippocampal Slices Maintained in a Small-Volume Recycling-, Perfusion-, and Submersion-type Chamber System. J. Vis. Exp. (2018).

このビデオでは、シナプスの活動を記録するために、水没室に脳スライスを設置する手順を示しています。このプロセスには、レンズ紙上にスライスを固定し、人工脳脊髄液(aCSF)の連続的な流れを維持してニューロンの生存率を確保し、刺激と記録電極を特定の脳の関心領域に対して正確に配置することが含まれます。この設定により、ベースラインのシナプス活動と電気刺激の影響を正確にモニタリングできます。

プロトコル

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動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 水中スライスチャンバーでのシナプス反応の記録

>注: 資料の表を参照してください。

  1. aCSF溶液をウォーターバスで約28〜30°Cに予熱します(これにより、記録チャンバー内の気泡形成が防止されます)。
  2. リサイクルシステム(4〜5 mL / min)を開始し、インラインヒーターを作動させてシステムを少なくとも1時間平衡化します。
  3. レンズクリーニングペーパーとU字型プラチナワイヤーに固定したナイロンメッシュを水没スライスチャンバーに数分間予浸します(図1)。
  4. U字型のプラチナ線を取り外します。
  5. リサイクルをオフにし、レンズクリーニングペーパーにスライスを置きます。
  6. スライス保持メッシュをすぐにスライスの上に置き、ポンプのスイッチを入れ、対物レンズをaCSFに浸さずにスライスを30分間平衡化させます。
  7. ホウケイ酸マイクロピペット(記録電極)にaCSF(チップ抵抗:1-2MΩ、1/3にaCSFを充填)を充填し、ピペットホルダーに取り付けます。
  8. テストしたエポキシ絶縁タングステン刺激電極をマニピュレーターホルダーに、基準線をスライスチャンバーに入れます。
  9. 2番目の参照電極をチャンバーに追加し、記録電極のヘッドステージの参照ソケットに接続します(図1A)。
  10. アンプ制御ソフトウェアで、「ゼロクランプモード」ボックスをクリックし、「出力ゲインリスト」ボックスをダブルクリックして続行します。ゲインを「100」に選択し、「ハイパスフィルタリストボックス(ベッセル)」をダブルクリックし、「0.1 Hz」を選択し、「ローパスフィルタリストボックス(AC)」をダブルクリックして「3 kHz」を選択します。
  11. 録音ソフトウェアで、「取得|エピソード刺激と10-20kHzで50-100msの増幅電位のデジタル化を可能にする設定があり、エピソード録音の開始から10ms後に自動的に刺激アイソレータをトリガーするプロトコルを選択してください。
  12. 例えば、刺激電極と記録電極をピラミッド層に対して一列かつ平行に配置します(図1Bおよび図2)。
  13. 「Acquire |「プロトコルの編集」をクリックし、「トリガー」タブ(ポップアップウィンドウ内)を選択します。「トリガーソース」ボックスをクリックし、トリガーソースとして「スペースバー」を選択します。「OK」ボタンをクリックしてください。「録音」ボタンをクリックして集録を開始し、トリガーボタンのあるポップアップウィンドウに注意してください。
  14. 刺激アイソレータソフトウェアで、「電圧制御」ボックスをクリックして「0」を入力し、「ダウンロード」ボタンをクリックします。「録音ソフトウェア」ウィンドウをクリックし、スペースバーを押します。このサイクルを繰り返して、1から8までの値を順番に入力します。たとえば、「電圧制御」ボックスに1mVステップで入力します。
  15. 刺激強度をfEPSPスロープ値と相関させ、fEPSPスロープの最大値の40%を得るために必要な刺激強度を決定します。「電圧制御ボックス」をクリックし、決定された値を入力します。「ダウンロード」ボタンをクリックしてください
    手記：刺激アイソレータは、脳組織に短い電圧または電流パルスを印加するために使用されます。二相性パルスは、位相ごとに100μsを持つことができます。
  16. 録音ソフトで、停止ボタンをクリックし、「取得」メニューをクリックします。「プロトコルの編集」をクリックし、ポップアップウィンドウの「トリガー」タブを選択します。トリガーソースボックスをクリックし、トリガーソースとして「内部タイマー」を選択します。「OK」ボタンをクリックしてください。たとえば、電界電位の自動記録を開始する記録ボタンをクリックします。30〜60分後に「停止」ボタンをクリックします。
  17. 「Acquire」メニューをクリックし、「Open Protocol」をクリックし、シナプス可塑性の所望の誘導プロトコルを選択し、「OK」ボタンをクリックしてください。「録音」ボタンをクリックすると、高周波刺激と録音が自動的にアクティブになります。「停止」ボタンをクリックします.
    手記：シナプス可塑性に関連する研究の場合、長期のベースライン記録後の長期増強または長期の抑制のための標準的な誘導パラダイムの1つを適用します。結果として生じるシナプス伝達の変調の代表的な例を図4と図5に示します。
  18. 録音ソフトウェアで、「取得|「Open Protocol」を選択し、ステップ4.12と同じプロトコルを選択します。「OK」ボタンをクリックしてから「録音」をクリックします。たとえば、2〜4時間、フィールドポテンシャル録音を自動的に実行し続けます。「停止」ボタンをクリックして録音を終了します。
  19. 医薬品研究の場合、恒久的な化合物投与が必要な場合は、化合物を直接aCSFリザーバーに適用します(図3)。

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結果

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figure-results-1
図1:水中スライスチャンバーでの実験のための流出-カルボジェンの成分。(A)水中スライスチャンバーのプレゼンテーション。海馬のスライスを保持しているナイロン繊維を備えたU字型のプラチナワイヤーが描かれています。銀線は小さなカニューレに巻き付けられ、銀線の先端の面積を増やすためのコイルを作成しました。刺激基準線は流出室に、記録基準線はメインチャンバーに置きました。参照電極の電位をさまざまな液体レベルで安定に保つために、記録参照ワイヤをプラスチックチューブで絶縁し、ワイヤの「水中」部分のみをバッファに露出させることができます。(B)明視野画像は、代表的な急性海馬切片と電極を示しています。CA1、CA3:コルヌアンモニス1、3;DG:歯状回;サブ:subiculum;EC:嗅内皮質。(C)回路図は、カ...

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開示事項

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
電気生理学機器および材料
縦型ピペットプーラーNarishige, 日本PC-10
除振テーブルMeirits, 日本ADZ-A0806
水中式記録室ワーナー・インストゥルメンツRC-26GLPの
サーモスタットウォーターバスZhongcheng Yiqi, 中国HH-1
4軸マイクロマニピュレーターSutter, アメリカMP-285、MP-225
プラチナワイヤー世界の精密機器PTP406
増幅器Molecular Devices社(米国)マルチクランプ700B
データ収集システムMolecular Devices社(米国)デジデータ 1440A
AnaysisソフトウェアMolecular Devices社(米国)クランペックス 10.2
蛍光顕微鏡Nikon, 日本FN1
LED光源Lumen Dynamics Group、カナダX-cite 120LED
マイクロピペットハーバードの装置GC150TFExtracelluarレコーディング
ホウケイ酸マイクロピペットSutter, アメリカBF150-86パッチクランプ
タングステン電極AMシステムズ、米国575500
蠕動ポンプLonger, 中国BT00-300T
チューブ、ISMATEC、ヴェルトハイム、ドイツSC03091x流入、内径:1.02mm
チューブ、ISMATEC、ヴェルトハイム、ドイツSC0319流出用チューブ2本、内径:2.79 mm
CCDカメラPCO, ドイツpco.edge sCMOS
レンズクリーニングペーパーコダック
50 mlコニカル遠心チューブサーモサイエンティフィック339652
プレチャンバーワーナー・インストゥルメンツBSC-パソコン
インラインヒーターワーナー・インストゥルメンツSF-28
温度コントローラーワーナー・インストゥルメンツTC-324Bの
必要な試薬
NaClSinopharm Chemical Reagent,
中国		10019318
KClのSinopharm Chemical Reagent,
中国		10016318
KH2PO4Sinopharm Chemical Reagent,
中国		10017618
MgCl2・6H2OSinopharm Chemical Reagent,
中国		10012818
CaCl2Sinopharm Chemical Reagent,
中国		10005861
NaHCO3Sinopharm Chemical Reagent,
中国		10018960
グルコースSinopharm Chemical Reagent,
中国		10010518
NaH2PO4Sinopharm Chemical Reagent,
中国		20040718
ヘープス シグマ H3375-J
ピルビン酸ナトリウム シグマ A4043 (英語)
MgSO4Sinopharm Chemical Reagent,
中国		20025118
NaOHSinopharm Chemical Reagent,
中国		10019718
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