新生児げっ歯類からの脳幹脊髄製剤の電気生理学的記録

要約

出典:Rousseau, J., et al. 新生児げっ歯類からの分離された脳幹脊髄製剤の電気生理学により、神経呼吸ネットワーク出力の記録が可能になります。J. Vis. Exp. (2015年)。

このビデオは、新生児のげっ歯類から分離された脳幹-脊髄製剤の電気生理学的記録を示しています。調製物を記録室に入れ、脳幹からの吸気バーストを、脊髄の第4腹側神経根を用いて酸素化および酸素欠乏条件下で記録する。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. セットアップと準備

1. ソリューション
   1. 以下のレシピに従って、人工脳脊髄液(aCSF)ストック溶液を調製します。濃度のバリエーションがある他のレシピは、文献で入手できます。ストック溶液は4°Cで最大1ヶ月間保存してください。
      1. 食塩溶液:NaCl 75.39 g(最終129 mM)、KCl 2.5 g(最終3.35 mM)、NaH₂PO4 0.81 g(最終0.58 mM)、MgCl₂ 2.33 g(最終1.15 mM)、CaCl₂ 1.85 g(1.26 mM)を添加します。800mlの蒸留水に溶解し、蒸留水で1Lまで満たします。
      2. 重炭酸塩溶液:17.65 gのNaHCO₃(最終21 mM)を加えます。900mlの蒸留水に溶解し、次に蒸留水で1Lまで満たします。重炭酸塩濃度が変動すると、pHが変動します。
      3. グルコース溶液:54.06gのグルコース(最終30 mM)を加えます。400mlの蒸留水に溶解し、次に蒸留水で500mlまで満たします。
   2. 100 mLの塩溶液、100 mlの重炭酸塩溶液、および50 mlのグルコース溶液を1 Lの蒸留水に希釈して、aCSFを調製します。使用するまで4°Cで保管してください。
   3. ガラス管を温めて割れるまで伸ばして、ガラス電極を準備します。使用する前に先端を研磨してください。電極は清潔な状態が保たれている限り、何度も再利用できます。
2. 実験セットアップ
   手記：セットアップの詳細を図 1 に示します。
   1. アンプ、移動平均器、データ収集システム、温度コントローラー、ポンプをオンにします。信号の増幅(ゲイン = 10,000)、フィルタリング(低スレッショルド、10 Hz、高スレッショルド、5 kHz)、および生信号のアナログからデジタルへの変換のサンプリングレート(2.5 kHz)を確認します。
   2. ボトルにaCSFを入れ、カルボゲン(95%O₂、5%CO₂)で泡立てます。記録チャンバー(容量5 mL)で4 mL/minで気泡および加温されたaCSFの流れを誘導します。記録チャンバー内の温度を26°C(± 1)に保持し、これらの標準条件ではpHを7.4にする必要があります。
   3. 50 mLの室温(RT)とカルボゲンバブルaCSFを解剖チャンバー近くの50 mLシリンジに保管します。
   4. コンピュータの電源を入れ、録音ソフトウェアを起動します。

2. 解剖

1. 動物の性別を量り、視覚的に判断します(オスは肛門性器の距離が長く、メスは肛門性器の距離が短く、男性の性器はしばしば暗く、女性の性器はピンク色です)。
2. 次のオプションのいずれかによって新生児げっ歯類を麻酔します:凍結麻酔(動物を4〜5分間氷に完全に浸す)、注射(4 ml / kgのキキテンシン)、または揮発性麻酔薬(イソフルランまたはエーテル)の吸入。足の離脱反射がないことにより、適切な麻酔面を確認します。
3. 動物をベンチに置き、腹側を下にして置きます。頭の吻側部分を、ブレグマレベルでメスで冠状に切断します(皮膚と頭蓋骨を通して見えます)。動物が麻酔された直後にこの手順を実行します。
4. 前部のメンバーの下にメスで体を冠状に切片にします。
5. 皮膚、筋肉、脂肪組織、粘液を外科用および薄いはさみとペンチで取り除きます。この年齢では骨が柔らかいため、神経系を傷つけないように注意してください。この手順はベンチで実行します。
6. 調製物を解剖室に入れます。シリンジに保存されたaCSFを使用して、調製物を酸素化します。この時点から録音の最後まで、顕微鏡を使用します。
7. 製剤の背側の面で、頭蓋骨と椎骨を吻側から尾側部分まで中軸に沿って外科用および細いはさみとペンチで切り取ります。神経組織を露出させるために、切り取った頭蓋骨と椎骨を開きます。シリンジに保存されたaCSFを使用して、調製物を酸素化します。
8. ペンチで、神経組織の表面を覆っている薄い組織であるくも膜を取り除きます。軟膜と血管を神経組織に対して保持します。シリンジに保存されたaCSFを使用して、調製物を酸素化します。
9. 背側を下にして製剤を置き、製剤を所定の位置に保持したまま、ハサミで神経と結合組織を切断して脳幹と脊髄を慎重に下ろします。背側アプローチも可能です。根と神経をできるだけ長く保ちます。骨を取り除き、脳幹と脊髄を分離します。シリンジに保存されたaCSFを使用して、調製物を酸素化します。
10. 小脳と残りの吻側構造をメスで切片化して取り除きます。針に保存されたaCSFを使用して、製剤を酸素化します。.
11. オプションで、実験デザインに応じて、メスで下小脳動脈の前方の冠状切片でポンを取り除きます。橋全体を保持すると、ラットではリズムが遅くなり、マウスではリズムが完全に抑制されることに注意してください。橋の尾側部分のみを含む製剤は、C4根で安定した周波数で呼吸器のような活動を示します。

3. 録音

1. 調製物を記録チャンバーに置き、腹側を上にして置く。脊髄の最も低い部分と脳幹の最も吻側部分のピンで製剤を固定します。
2. 電極に針でつながれたシリンジを用いて、シリンジピストンを引き抜いて電極(ガラス先端径150〜225μm)にくぼみを誘導し、電極にaCSFを部分的に充填します。
3. マイクロマニピュレータを使用して、電極を4番目の腹側根の1つに慎重に近づけます。他の腹側根も呼吸器様の活動を示す可能性があります(例:XII脳神経、C1腹側根)。
4. 神経根を穏やかに吸引するために、ピストンを引き抜くことにより、シリンジを介して電極タンク内の陥凹を誘発します。次に、電極を慎重に動かして脊髄に当てます.
   手記：理想的には、ルートレットのサイズが電極開口部のサイズと一致し、電極の内部コンパートメントと外部コンパートメントの間にシールを作成します。このような記録には差動増幅器が一般的に使用されているため、電極内部と記録室の間に開口部があると、信号の品質が低下し、バックグラウンドノイズの除去が困難になります。
5. 録音を開始します。
6. 正常酸素条件下で調製物によって生成されたリズムを記録します(すなわち、カルボゲンで泡立ったaCSF:95%O₂および5%CO₂)少なくとも20分間、調製物のベースラインパラメータを決定します。
7. 灌流をカルボゲンバブル aCSF から刺激 aCSF に切り替えます (つまり、低酸素刺激の場合は 95% N₂ と 5% CO₂ でバブル化します) 15 分間、実験プロトコルに応じて曝露時間を変更します。記録と動物のデータシートに露光時間を記録します。チューブの外側へのガス拡散を避けるために、可能な限りaCSFボトルとチャンバーの間にステンレス鋼管を使用してください。
8. 回収記録のために、灌流を標準のカルボゲンバブル aCSF に少なくとも 15 分間戻します。これを記録および動物のデータシートに記録して下さい。
9. 録音を終了します。

結果

図 1. セットアップの反復スキーマ。気泡したaCSFは、記録チャンバー内のポンプで温められ、送り込まれます。記録室内の余分なaCSFはポンプで吸引され、処分されます。記録室は、グランドと温度コントローラーにリンクされています。電極出力は、アンプに直接中継され、次に移動平均器とデータ収集システム、最後にコンピューターに中継されます。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
シルガード	シグマ・アルドリッチ	761036から5EA	フードの下で使用
NaCl	バイオショップ	SOD002
KClの	バイオショップ	POC888
CaCl2	バイオショップ	CCL444
MgCl2	バイオショップ	マグ510
NaHCO3	バイオショップ	SOB999
NaH2PO4	バイオショップ	SPM306
D-グルコース	バイオショップ	グル501
カルボゲン	リンデ	〒343-02-0006
温度コントローラー	ワーナーインストゥルメンツ、ハムデン、コネチカット州、米国	TC-324Bの
吸引電極	AMシステムズ、エベレット、ワシントン州、米国	モデル573000
差動ACアンプ	AMシステムズ、エベレット、ワシントン州、米国	モデル1700
移動平均線	CWE, アードモア, ペンシルベニア州, アメリカ	モデル MA-821
データ取得システム	Dataq Instruments、米国オハイオ州アクロン	モデル DI-720
LabChartソフトウェア	ADInstruments, Colorado Springs, CO, USA (米国コロラド州コロラドスプリングス
プリズムソフトウェア	Graphpad, La Jolla, CA, USA (米国カリフォルニア州ラホーヤ)
録音室	自家製
基	Kanetec、ベンセンビル、イリノイ州、米国
マイクロマニピュレーター	World Precision Instrument Inc, サラソタ, FL, USA	メガバイト
基	Kanetec、ベンセンビル、イリノイ州、米国	カイトR
蠕動ポンプ	ギルソン、ミドルトン、ウィスコンシン州、米国	メガバイト
ファラデーケージ	自家製	ミニパルス3
コンピュータ

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