動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 手術の準備
- 安全で無菌手術を確保するために、送信機を清掃して準備します。送信機を帯電防止パッケージから取り出し、70%エタノールにスプレーまたは浸します。送信機を滅菌生理食塩水ですすぎ、滅菌生理食塩水に浸した滅菌綿スポンジの間に置くか、滅菌生理食塩水に浸したままにします。
- 手術に必要な道具を集めて滅菌し、滅菌のためにオートクレーブをスチームします。手術器具のリストについては、材料と試薬の表を参照してください。
2. 外科的移植
- 動物に麻酔をかけ、IACUCが承認したプロトコルに従って麻酔を維持します。開始時および手術中に、15分ごとにつま先つま先つまみ反射を確認してください。反応がないことは、十分なレベルの麻酔を示しています。
- 子犬の場合は、イソフルラン(4%)とO2(100%)による麻酔を使用します。成人の場合は、ケタミン(100 mg / kg)とキシラジン(10 mg / kg)を併用します。.
- 定位固定装置フレームに位置を固定します。イヤーバーの先端を耳道に置きます。若いラットの子犬の頭蓋骨は非常に柔らかいため、イヤーバーを過度に締めないでください。麻酔用ノーズコーンを固定します。
- 手術中は、37°Cに設定された加熱パッドに動物を置いて、動物を暖かく保ちます。成体動物では、動物の目に潤滑軟膏を塗布します。
- 切開部位を滅菌し、無菌の手術野を維持します。
- 70%エタノールとベタジンを交互に塗布して頭皮を綿棒で拭きます。頭皮の中心から始めて、ますます広い同心円を作ります。
- 動物をドレープで覆い、ドレープされた動物に手術を行います。手術用セットアップを滅菌ドレープで裏打ちし、70%エタノールを装置にスプレーすることにより、滅菌手術野を維持します。
- 滅菌手術用手袋とガウンを着用してください(または機関の要求に応じて)。無菌フィールドを維持するために、外科助手を使用してください。
- 動物の頭皮を正中線に沿って目の少し後ろ、約2 cmで切開します。メスを挿入するときは、若いラットの子犬の頭蓋骨がまだ非常に柔らかいため、注意してください。切開部の出血が少なくなり、治癒が速くなるように、1回のカットを行います。
- 頭蓋骨を露出させます。送信機と頭蓋骨の骨との間の結合を最大化するために、清潔で乾燥した領域を準備します。動脈瘤クリップを使用して頭皮をつかみます。
- 頭皮を四隅の正中線からそっと引き離します。頭蓋骨のブレグマやラムダなどの解剖学的なランドマークを探してください。この年齢の動物では頭蓋骨が融合していないことを忘れないでください。固定装置座標のPaxinosアトラスを使用して、バリ穴の正しい位置を見つけます。
- ドレメルタイプの工具とバリタイプのドリルビットを使用してください。目的の記録位置に2つのバリ穴を作成し、穴の直径が300μmを超えます。参照電極のバリ穴を頭蓋骨のラムダの後ろの小脳の上に置きます。
- 送信機のワイヤーがバリ穴と揃っていることを確認します。電極線が整列していないと、電極の接着剤が汚染される可能性が高く、信号が悪くなります。ワイヤーを位置合わせするには、送信機のはまり具合を確認し、電極をゆっくりと曲げて、バリ穴の目的の場所に合わせます。
- 電極リード線をトリミングします。手術用ハサミを使用して、電極を希望の長さにトリミングします。電極の深さは、実験に必要な記録の種類にとって重要です(つまり、EEG記録のために電極を硬膜の上に配置するか、定義された脳構造のために定位固定装置座標を使用します)。
- トランスミッターのベースにシアノアクリレートをたっぷりと塗布して領域を覆い、電極のコーティングを避けてください。シアノアクリレート接着剤は電気絶縁体であり、電極を接着剤で汚染すると信号が発生しません。
- 脳深部構造から記録する場合は、送信機をカニューレホルダーに取り付け、Z軸制御のために定位固定装置アームに配置します。定位固定アームを使用して送信機を適切な深さまで下げ、送信機の周りにシアノアクリレートゲルを配置します。
- 送信機を配置する前に頭蓋骨を完全に乾かして、強力な接着接着を確保します。シアノアクリレートでコーティングされた送信機を頭蓋骨に塗布します。電極を対応するバリ穴に位置合わせするように注意してください。
- 主要な血管構造を損傷しないようにしてください。送信機をわずかな圧力で1分間所定の位置に保持します。わずかな圧力を使用して、送信機と頭蓋骨の間に強力な結合を形成します。
- 送信機/頭蓋骨のインターフェースを完全に密閉するのに十分な追加のシアノアクリレートを塗布します。良好なフィット感と強力な接着を確保するには、頭蓋骨に接触する接着剤の表面積を最大化します。シアノアクリレート接着剤を送信機の周囲に円を描くように塗布し、頭蓋骨と送信機の壁の両方が覆われていることを確認します。
- 注入された送信機の基部にあるシアノアクリレートの周りのシリンジを通して化学促進剤(0.1 ml)を塗布します。.促進剤は、隣接する組織に塗布しないように注意しながら、控えめに使用してください。
手記：シアノアクリレート硬化の化学的加速により、トランスミッターと頭蓋骨との間の強い結合が迅速に形成されます。シアノアクリレート促進剤は、接着剤の硬化を速めるのに役立ちますが、必須ではありません。
- 滅菌生理食塩水でその領域を完全に洗浄することにより、促進剤を取り除きます。.シアノアクリレート促進剤は、切開部から洗浄しないと組織刺激を引き起こす可能性があります。その領域を洗浄するには、1.0 mlのシリンジに滅菌生理食塩水を満たし、シリンジ針で領域を洗浄します。一般的に、0.5mlの生理食塩水は促進剤を洗い流すのに十分です。
- 送信機の基部の周りの皮膚を縫合しますが、送信機を覆わないでください。神経信号を効率的に伝達するには、送信機の上部が皮膚より上にある必要があります。送信機の周りの皮膚とユニットの周りの接着剤は適度に引き締まっている必要があります。Vicrylまたはシルク縫合糸(柔らかい糸)を使用します。未成熟な動物の皮膚は柔らかく、柔らかい縫合糸を使用しないと簡単に損傷を受けます。成体動物の場合は、任意の縫合材料を使用してください。
- 動物を脳定位固定装置フレームから取り外し、回復のために加熱された毛布の上に置きます。
- ダムに戻る前に、動物が暖かく(37°C)、歩行可能(つまり、完全に回復)していることを確認してください。動物の背中の皮膚をつまんで、動物が水分を補給していることを確認します(動物が脱水状態の場合、皮膚は変形したままになります)。動物が脱水状態にある場合は、授乳中のリンゲル緩衝液の皮下注射を投与します。.動物が胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。
- 術後の疼痛管理のために動物にブプレノルフィン(0.05 mg / kg)を投与し、注射部位の周囲に0.1 mlのブピバカインを皮下注射します
手記： 開始から終了まで、この年齢の動物の場合、全手順は5〜10分で完了する必要があります(出生後6日目)。高齢の動物の場合、手術時間が長くなる場合があります。
3. 介護と住宅
>注:一部のダムでは、デバイスに埋め込まれた子犬を許容できない場合があります。許容範囲に強いダムを選択する必要があるかもしれません。ダムが子犬を送信機で拾い上げてケージの周りを移動することは許容されます。
- 動物が離乳したら、ケージメイトからデバイスが取り出されるのを避けるために、単独で飼育します。
- 苦痛の兆候が見られる場合は、致死量のペントバルビタール(25 mg / kg)またはイソフルラン(ベルジャー内)で動物を安楽死させます。.
- 注意:ワイヤーインサート付きの動物用ケージの中には、埋め込まれた送信機に干渉するものがあります。ワイヤーインサートの高さを確認して、動物が送信機をワイヤーインサートの「バー」の間に挟まないように注意してください。
4. 脳波の記録
- 動物を単独でケージに入れるか、同腹仔やダムと一緒に飼育します。ただし、1つのケージに移植された動物は1匹だけ置きます。子犬を録音室に2時間以上放置しないでください。苦痛や脱水症状の兆候がないか動物を監視します。
- 付属の電源をレシーバーベースに接続し、電源ライトが点灯していることを確認します。バヨネット・ニール・コンセルマン(BNC)ケーブルを使用して、レシーバーベースをデータ収集システムに接続します。
- 動物用ケージをレシーバーベースの上に置きます(図1)。「信号」ライトが点灯し、送信機が検出されたことを示します。これで、データを記録できます。
- データを記録するには、レシーバーベースをアナログ-デジタルコンバーターに接続し、コンバーターをコンピューターに接続します(図2)。
- 録音のサンプリングレートを設定します。データが適切にサンプリングされていることを確認します。録音には少なくとも250HzのSampリングレート(500 Hzを推奨)を選択します(送信機の帯域幅は0.1〜100 Hzです)。
- デジタル化されたデータを保存し、Matlabなどの信号処理ソフトウェアパッケージを使用して解析します。
