海馬脳切片における破傷風刺激を用いた局所的なCornu Ammonis 1 (CA1) Gamma Ocillationsの生成

要約

出典:Hatch, R. J., et al.破傷風刺激による局所Ca1 γ振動の生成。J. Vis. Exp. (2015年)。

このビデオでは、破傷風シミュレーションを使用して、CA1海馬マウスの脳スライスに局所的なCA1ガンマ振動を誘導する手順を示しています。この方法は、ニューロンネットワークの活動を理解するために重要です。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 脳スライスを切断するためのセットアップ

1. (mM)125 Choline-Cl、2.5 KCl、0.4 CaCl₂、6 MgCl₂、1.25 NaH₂PO₄、26 NaHCO₃、20 D-グルコースをカルボゲンガス(95%O₂〜5%CO₂)で飽和させた切断液と、(mM)125 NaCl、2.5 KCl、2 CaCl₂、 2 MgCl₂、1.25 NaH₂PO₄、26 NaHCO₃、10 D-グルコース、カルボゲンで飽和。切断液を氷の上に置いて冷たく保ちます。
2. 約400mlの切断液を凍結し、100mlの凍結していない切断液とブレンドして氷のスラリーを作ります。カルボゲン(95%O_、O、2〜5%、CO₂)を約0.5 L/minの流れで、小口径のチューブまたは焼結ガラスを通って、安定した、しかし穏やかな気泡の流れを作り出します。
3. 脳のスライスが置かれる隆起したナイロンメッシュインサートを備えた250mlのビーカーを準備します。CSFを充填してメッシュを約2cm覆い、カルボゲンで泡立てて、気泡がスライス保持領域を直接乱さないようにします。また、ナイロンメッシュに気泡がないことも重要ですので、気泡がある場合は取り除いてください。これが保持チャンバーとなり、室温(20〜25°C)に保たれます。
4. 大きなハサミ、小さなハサミ、小さなマイクロヘラと大きなマイクロヘラ、大小の鉗子などの解剖器具をレイアウトし、氷の上で冷やします。ビブラトーム組織切断ブロックをアルミホイルの正方形の上の氷の上に置きます。6cmの濾紙2枚、片刃のカミソリの刃、および切断液スラリーで満たされた25mlのビーカーも入手します。
5. 2つ目の容器に氷を入れ、氷の上にティッシュペーパーを置き、その上に12cmの培養皿を置きます。培養皿に切断液、氷スラリー、およびカルボゲンで泡詰めます。これは、脳の解剖が行われる容器です。
6. ビブラートを準備します。新しい両刃のかみそりの刃を包みから取り出し(毎回新しい刃を使用してください)、80%エタノールをスプレーしてから脱イオン水をスプレーします。3 mlのプラスチック製トランスファーピペットを、先細りになり始めた場所でカットします。これは、脳のスライスを転送するために使用されます。27 Gの針を基部で約45°曲げ、1 mLのシリンジに取り付けます。これは、カット中にスライスを操作するために使用されます。

2. 脳のスライスを切る

1. マウス(P16-P18)を2%イソフルランまたは現地で承認された方法で麻酔します。誘導に続いて、大きなハサミで動物の首を切り落とし、泡状の切断液スラリーが入った12cmの培養皿に頭を落とします。スラリーは、急速冷却のためにヘッドを完全に浸す必要があります。
2. 片手で頭の前部を持ち、皮膚と結合組織を鼻に向かって前方に剥がします。小さなハサミを使用して結合組織を切断し、下にある頭蓋骨を明らかにします。次に、頭蓋骨と首の背側を覆っている筋肉を取り除きます。
3. 最初に大きな鉗子で頭蓋骨の前面を固定し、次に小さなハサミを使用して大孔の両側の骨に2つの横方向の切り込みを入れて、頭蓋骨から脳を取り出します(図1、A1およびA2とラベル付けされた切り傷)。
   1. 目の間(ブレグマのすぐ前)に別の切り込みを入れ(図1、Bとラベル付けされた切り取り)、次に矢状縫合糸に沿って前方に慎重に切り込み、切り取った頭蓋骨部分を反射して脳を露出させます(図1、Cとラベル付けされた切り取り)。
   2. 小さなヘラを使って脳をすくい取り、培養皿に置きます。切断する必要がある脳の下面の脳神経に注意してください、これは小さいサイズのマイクロヘラを使用して行うことができます。大きなヘラを使用して、切断液スラリーで満たされた25mlビーカーに脳を移します。
4. スライスのための脳半球の準備。
   1. 6cmの濾紙を1枚、新鮮な培養皿の底に置き、新鮮な切断液、スラリー、泡を入れます。大きい方のヘラを使用して、腹側を下にして脳を濾紙の上に置きます。新しく掃除された片刃のカミソリの刃を取り、脳を切って小脳を取り除き、次に正中線に沿って切開して脳を2つの半球に分離します。
5. ビブラトーム組織ブロックの準備。
   1. 冷やしたビブラトーム組織ブロックを取り、表面を乾燥させ、中央にシアノアクリレート接着剤を一滴垂らし、脳のおおよそのサイズに均等に広げます。小さなヘラを使用して、脳の半球の1つを大きなマイクロヘラに操作し、脳の内側が下になるようにします。
   2. 2枚目の濾紙の脳の界面にあるへらの端に触れて、溶液をできるだけ多く取り除きます。小さなヘラを使用して、脳を大きなヘラからスライドさせて接着剤に導きます。
   3. カッティングブロックをビブラトームチャンバーに固定し、チャンバー内にカッティング溶液のスラリーと泡を充填し、脳が完全に浸るようにします。脳の腹側がブレードに面するようにカッティングブロックを回転させます。
6. 脳をスライスする.
   手記： 各ビブラトームは一意であるため、製造元の指示に従ってください。
   1. スライスの厚さを450μmに設定し、ブレードが約0.3mm/sの速度で脳内を移動するときに振動していることを確認します。腹側から皮質表面まで脳全体を完全に切断すると、電気生理学的記録に使用できる全脳矢状スライスが生成されます。スライスは横方向から内側に製造され、通常は各半球から3〜4スライスを切り取ることができます。
   2. スライスのベースが持ち上がった場合は、曲げた27Gの針を使用して、スライスをゆっくりと押し戻します。各スライスをカットしたら、トランスファーピペットを使用して、最大8時間生存可能な保持チャンバー内のプラットフォームに移動します。

>3. 細胞外電気生理学の記録

1. スライスを記録チャンバーに取り付けます。
   1. トランスファーピペットを使用して、1〜2 ml / minで流れ、32°Cに加熱されたaCSFで灌流された水中記録チャンバーに脳スライスを置きます。記録に使用されるaCSFは、Mg²⁺濃度が2 mMから4 mMに増加するため、保持チャンバー内のものとは異なります。
   2. 「ハープ」(半円形のステンレス鋼で、ナイロンストランドを2〜3 mm間隔で伸ばしたもの)でスライスを固定します。ストランドがCA1と平行に走るようにハープを配置します。灌流速度を32°Cで8〜10 ml / minに上げます。
2. 解剖顕微鏡下で、CA1のラジタム層の表面に刺激電極と記録電極(aCSF記録溶液を充填したガラス電極)を配置します(図2A)。最初に刺激電極を配置し、次に記録電極を配置します。
3. 120 μA から 150 μA の振幅と 0.1 ミリ秒の持続時間で Schaffer の担保を刺激し、結果として生じる磁場の興奮性シナプス後電位 (fEPSP) 波形を観察して、スライスの健康状態を判断します (図 2B)。刺激電極と記録電極は、小さなファイバーボレーと大きな振幅でfEPSP記録を得るために、スライス表面から約50〜100μmのスライスに移動する必要がある場合があります。Schafferの担保が誘発するfEPSPはステレオタイプであり、スライスの健康状態の良い指標を提供します。健康なスライスは、通常、ファイバーボレーとfEPSPの振幅比が0.3未満であることを示しています。
4. 電極の再配置。
   1. 解剖顕微鏡を使用して、図3Aに示すように、刺激電極を層状中央に移動し、記録電極を記録電極にできるだけ近い錐体細胞層に移動します。刺激電極と記録電極は、120 - 150 μA のテストパルスに対する fEPSP 応答振幅が約 1 mV になるように、約 50 - 100 μm のスライスに押し込む必要がある場合があります。
5. γ振動を発生させる。
   1. γ振動を発生させるには、200 Hzで送達される20 x 0.1ミリ秒のパルスの列で組織を刺激します。この破傷風刺激は、5分ごとに送達すると再現性のある反応をもたらすことができます。
6. 次の録音パラメータを使用します。
   1. 出力信号のゲインを、A/Dコンバータの入力電圧範囲に一致するようにスケーリングします。予想される最大信号エクスカーションが入力電圧範囲の 30% 以上を使用していることを確認してください。ゲインを高く設定しすぎると、信号がクリップする可能性があるため、注意してください。フィールド録音に必要な一般的な帯域幅は500Hzで、ベースラインドリフトを除去するために0.1HzのACカップリングがあります。
   2. 信号のエイリアシングを避けるために、ローパスフィルターのコーナー周波数よりも少なくとも4〜5倍速くデジタル化します。

結果

図 1.頭蓋骨とその上にある皮膚の概略図で、脳を明らかにするための切り傷の位置を示しています。A1、A2、B、Cは、脳の除去のために頭蓋骨を開くために行う必要のある切り傷の位置を示しています。

図 2.CA1 Schafferの担保に刺激電極と記録電極を配置して、スライスの健康状態をテストします。(A)刺激電極(Stim)と記録電極(Rec)の配置を示す。(B)120μAの刺激によって誘発されるfEPSPの代表例(*でマークされたファイバーボレー)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
4-(N-エチル-N-フェニルアミノ)-1,2ジメチル-6-(メチルアミノ)ピリミジニウムクロリド(ZD7288)	シグマ・アルドリッチ	Z3777
ビウクリン	シグマ・アルドリッチ	14340
6-シアノ-7-ニトロキノキサ-ライン-2,3ジオン(CNQX)	シグマ・アルドリッチ	C127
ニッケル	シグマ・アルドリッチ	266965
カルバマゼピン	シグマ・アルドリッチ	C4024
(2R)-アミノ-5-ホスホノペンタノ酸(APV)	トクリス・バイオサイエンス	105
レチガビン	ケムパシフィック	150812-12-7
コリン-CL	シグマ・アルドリッチ	C1879-5KG
KClの	シグマ・アルドリッチ	P9333-500G
NaH2PO4	シグマ・アルドリッチ	S9638-250G
NaHCO3	シグマ・アルドリッチ	S6297-250G
NaCl	シグマ・アルドリッチ	S7653-5KGシリーズ
グルコース	シグマ・アルドリッチ	G8270-1KG
CaCl2.2H2O	シグマ・アルドリッチ	223506から500G
MgCl2.6H2O	シグマ・アルドリッチ	M2670-500G
電極ガラス	ハーバード大学装置	GC150F-10
同心円バイポーラ刺激金属電極	FHCの	CBBPF75
デジタルアイソレータ	インストゥルメントの入手	モデルBJN8-9V1
モデル1800アンプ	A-Mシステム	モデル1800アンプ
デジタイザー	ナショナルインストゥルメント	NI USB-6211
バイブロトーム	ライカ	VT1200番台