揮発性臭気物質に応答したショウジョウバエSensillaの電気生理学的記録

1. at4 録音のためのハードウェアの準備

1. ピペットプーラー装置を使用して、アルミノケイ酸塩ガラスキャピラリー(外径1.0 mm、内径0.64 mm)の電極を調製します。参照電極の先端を一対の細い鉗子でわずかに鈍くして、フライのクリペウス(つまり、フライヘッドの前面、口器の上にある丸みを帯びたプレート)への挿入を容易にします。
   注:この研究では、生後7日齢のWT(野生型)雄(ベルリン)を使用しました。AHL生理食塩水は、両方の電極の電解質として使用します。
2. 900mLの蒸留水を6.312gのNaCl、0.373gのKCl、0.337gのNaHCO₃、0.1120gのNaH2PO4、1.892gのトレハロースּ2H2O、3.423gのスクロース、1.192gのHEPES(N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸)と混合して、1LのAHL(成人血リンパ様)を調製します。 および8.2mLの1M MgCl₂。蒸留水を使用して、総容量を1 Lまで上げ、1 N NaOHを使用してpHを7.4にし、真空駆動フィルターシステムで溶液を滅菌します。長期保存の場合は、AHLアリコートを4°Cに保ちます
   注:パルミトレイン酸の一貫した供給は、カートリッジ間の均一性に左右されます。各カートリッジは、再現可能な方法で組み立てる必要があります。
3. カミソリの刃を使用して、200 μLピペットチップの先端から0.9 cmを取り外し、最初のカートリッジセクションを作成します。寸法は4.1 cmです。図1Aに詳述されている寸法を参照してください。別の200 μLピペットチップを使用し、チップとベースから1.7 cmと1.5 cmを取り外して、2番目のカートリッジセクションを作成します。 1.8cmの大きさです(図1A)。定規を使用して再現性を確保します。
4. 1/8インチの穴あけ器を使用して、濾紙からディスクを切り取ります。
5. 鉗子を使用して、2番目のカートリッジセクションの先端に濾紙ディスクを置きます。カートリッジ先端に空気が通る開口部があることを目視で確認します。
6. 図1Aに示すように、第1および第2カートリッジセクションを取り付けます。第2カートリッジセクションを下向きに傾けて、プレップを直角に狙いやすくします(図1B)。
7. マイクロマニピュレーターに取り付けられた臭気送達チューブにカートリッジを接続します.
   注意: この設計により、カートリッジを外側に回転させて交換を容易にすることができます(図1C)。
8. 1つのマスコントローラーで一定の加湿エアフローを2 L / minに設定し、別のマスコントローラーで臭気物質フローを500 mL / minに設定します。
9. ソフトウェア(資料の表を参照)を使用して、500ミリ秒の臭気パフを投与する手順をプログラムします。

2. パルミトレイン酸の送達用臭気液の調製

>注:Or47b ORNは、シスパルミトレイン酸とトランスパルミトレイン酸の両方に反応します。パルミトレイン酸はRTでは不安定であるため、ストックは-20°Cで保存し、開封後1ヶ月以内に使用します。エタノールは、パルミトレイン酸に最適な溶媒です。

1. ボルテックスミキサーを使用して、10 μLのシスまたはトランスパルミトレイン酸ストックまたは希釈液を90 μLの100%エタノールと完全に混合し、1.7 mLマイクロチューブで10倍段階希釈します。実験前に新鮮なパルミトレイン酸希釈液を毎日調製し、1日以内に使用してください.
   注:エタノールに溶けない臭気物質には、他の種類の有機溶剤で臭気希釈液を調製するために、ガラスバイアルをお勧めします。
2. P10マイクロピペットを使用して、対応する各カートリッジの濾紙に、所望の希釈液のシスパルミトレイン酸溶液5μLを塗布します><。 注:最高投与量(^10-1)には、450μgの化合物が含まれています。トランスパルミトレイン酸溶液の場合は、代わりに4.5μLを適用して、最高投与量(^10-1)に450μgの化合物が含まれるようにします。
3. パルミトレイン酸カートリッジを真空デシケーターに室温と7.59mmHgの圧力で1時間置き、溶媒を完全に蒸発させます
   注:カートリッジはRTで最大4時間使用できます。

3. in vivo 電気生理学的記録のための at4 Sensilla への即時アクセスのためのショウジョ

>注:WTフライ(ベルリン)は、12:12の明暗サイクルで25°Cの標準的なコーンミール培地で飼育されます。産卵後、ハエは性別によって10匹のグループに分けられ、それによって7歳までグループで飼育されます。オスとメスの両方のハエのOR47b ORN(嗅覚受容体ニューロン)はパルミトレイン酸に反応します。簡単にするために、現在の研究ではオスのハエのみが調査されています。

1. フライプレップスライドを組み立てる:スライドガラスの上に、ガラスカバースリップ(18 x 18 mm2)を少量のモデリング粘土の上に置き、スライドガラスと~3°の角度を形成します。カバースリップの内側の端とスライドのすぐ下の領域に両面テープを貼ります。記録するたびに新しいテープと交換します(図2A)。
2. フライアスピレーター15を使用して目的のフライをチューブに集め、次に200μLのピペットチップをチューブの端に取り付けます。同時に、チューブを前方にフリックし、チューブに空気を吹き込みながら、フライをピペットチップの端に押し込みます。カミソリの刃を使用して、フライの体のすぐ下、フライの2頭の長さを切ります。
3. ピペットの先端の底をモデリング粘土で軽くたたいて、アンテナとクリペウスの両方が露出するまでフライを上に押し上げます(図2B)。ハエを殺さないようにするには、ハエの腹部が押しつぶされるのを防ぐため、触角とアリステを露出させるのに十分な粘土のみを追加します。さらに、粘土をゆっくりと穏やかに加えることで、急なくびれを防ぎます。ハエが生きていることを確認して、触角またはテングの動きを確認します。
4. 鉗子を使用して、フライを収容するピペットチップを操作します。クリペウスが観察者の右側を向くように頭を向けます。アンテナの側面がテープで留められたカバーガラスの表面に当たるまで、細い鉗子を使用してカバーガラスに沿って準備を調整します(図2B)。
5. アリスタに保持ロッドを配置して、アンテナを両面テープに固定し、動きを防ぎます(図2B).
   注:保持ロッドは、ピペットプーラーでホウケイ酸ガラスキャピラリーから引き出され、モデリングクレイで所定の位置に保持されます(図2A)。
6. リグのステージに準備を置きます(図2C)。顕微鏡を使用して、アンテナの3番目のセグメントの遠位側縁に沿ってトリコイドが見えていることを確認します.
   注:センシラは背景に対してシルエットを浮かべて、識別を簡素化し、記録を容易にする必要があります(図3)。この準備では、最もアクセスしやすいトリコイドセンシラはat4タイプです。
7. 前述したように、図2、図15に示すように、調製物を一定の加湿空気流(2 L / min)下に保ち、調製物から約2cmのところに別の空気送達管を介して供給します(図4)。

4. パルミトレイン酸に応答したat4トリコイド中のOr47b ORNsからのat4 Sensillum活性の記録

1. 参照電極をclypeusに挿入します(図3A)。迅速かつ滑らかな動きで、電極が表面のすぐ下に挿入され、組織の損傷を避けるためにキューティクルの下の血リンパに接触できることを確認します。
2. 記録電極をゆっくりと下げて、ターゲットセンシラムと同じ view 平面(図3B)。50倍対物レンズで記録.
   手記：丈夫なトリコイドキューティクルは、記録電極をセンシラーベースに挿入する必要があり、その広い領域はより大きなターゲットを提供し、電極が偏向する可能性を減らします(図3B、挿入図)。
3. センシラムに臭気刺激を適用する前に、次の選択基準を遵守してください:これらの基準を満たさないトリコイドは拒否し、代わりに別のセンシラムを選択する必要があります。
   1. 高い信号対雑音比を観察します (例については、図 3C を参照)。
   2. at4Aおよびat4Cニューロンからの識別可能なスパイクを観察します(図3C).
      注:at4Bのスパイク振幅はat4A10と非常によく似ており、臭気刺激なしでは簡単に識別できません。
   3. at4Aニューロンの基礎発火率が約20Hz以下であることを観察します
      注:この基準は、ニューロンの基礎発火率が基礎ORNの発火率よりも高いため、at4Aに固有です。基底発火がはるかに高いことは、電極挿入中にニューロンが損傷した可能性があることを示しています。
4. カートリッジを臭気物質送達チューブに接続します。溶媒制御から始めて、次に低濃度から高濃度までの臭気物質から始めます。マイクロマニピュレーターを使用して、カートリッジをプレップに向かって操作し、カートリッジをプレップの頭に向けます。カートリッジが数ミリメートル離れたアンテナ(図4)に直接向けられていることを視覚的に確認します。
   注意: 目標は、カートリッジの開口部を直接アンテナに向け、ターゲット組織の近くに配置することです。
5. 臭気カートリッジが右側の記録電極から1〜2 mm離れ、下のフライプレップスライドから約1 mm離れていることを確認します。
   手記：ここで説明するセットアップでは、臭気カートリッジは、記録電極、参照電極、およびフライプレップスライド(図4)によって密接に接しています
   注意: カートリッジと記録/参照電極の間の距離を考慮してください。約4mmの距離をお勧めします。意図しない接触により、信号が終了し、記録電極の先端が壊れ、現在のニューロンが損傷し、さらなる記録が複雑になる可能性があります
   注:カートリッジとフライプレップスライドを隔てる距離を考慮してください。カバーガラスに触れると、記録電極が外れ、記録が中断される場合があります。
6. データ集録ソフトウェアの「録音」を押して録音を開始します.
   注:10秒の記録ごとに、ステップ1.9で説明されているように、500ミリ秒の臭気パルスが1つ直接アンテナに送られます。
7. 臭気物質を塗布した後、カートリッジを慎重に引っ込めてから、次に高濃度のカートリッジと交換してください。全投与量範囲が得られるまで続けます.
   注:適応の影響を避けるために、各フライから記録されるOr47b ORNは1つだけにすることをお勧めします。
8. その日の録音が終了したら、記録電極を蒸留水で十分にすすいでください。
9. 市販のオフライン解析ソフトウェアを使用してデータを解析し、プロットします。

図1:カートリッジと嗅覚計のセットアップ。(A)臭気カートリッジの調製。左から右へ:標準の200 μLピペットチップ、第1および第2カートリッジセクション、および完成した臭気カートリッジ。(B)カートリッジを嗅覚計に接続し、第2セクションの下向きの角度を示しています。(C)マイクロマニピュレーターに取り付けられた臭気送達チューブと、付属の臭気カートリッジを示す嗅覚計のセットアップ。

図2:ショウジョウバエの準備。(A)フライ、カバースリップ、および保持ロッドの相対位置を示す完全な準備。(B)フライの位置、触角の向き、およびそのクリペウスを示すプレップのクローズアップビュー。保持ロッドをアリスタの上に置き、3番目のアンテナセグメントを両面テープに固定します。(C)リグのセットアップ。すべての主要なコンポーネントには注釈が付けられています。

図3:SSRのat4 Sensillumの同定。(A)プレップの4倍ビュー、クライペウスに挿入された参照電極、アリスタの上にある保持ロッド、および第3の触角セグメントの近くに配置された記録電極を示しています。(B)電極の50倍ビュー、at4トリコイドへの挿入の態勢。挿入図:記録電極の位置の図。(C)ベースラインスパイク活動の代表的なSSRトレースで、信号対雑音比が良好(上)または不良(下)を示しています。良好なS/N比により、at4Aおよびat4Cスパイクを確実に識別できます。

図 4: カートリッジの配置。(A)臭気カートリッジは、数mmの距離からフライの頭を正面から狙っています。(C)フライプレップスライドの上の臭気カートリッジの位置を示す、調製および嗅覚計のクローズアップビュー。