出典: Fischl, M. J., et al. In Vitro Wedge Slice Preparation for Mimicking In Vivo Neuronal Circuit Connectivity. J. Vis. Exp.(2020年)
このビデオは、マウス脳のくさびスライスの内側の乏蝸牛ニューロンの聴覚神経根を刺激し、シナプス後電流を記録するためのプロトコルを示しています。
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方法論記事
マウス脳ウェッジスライスにおける聴神経根刺激とシナプス後電流記録
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2025年7月8日
この記事について
要約
プロトコル
動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。
1. 電気生理学のセットアップと記録
- ウェッジスライスを録音チャンバーに置き、ハープまたはスタビライジングシステムでスライスを固定します。カルボゲンで泡立たせた温かい(35°C)ACSFを使用して、7〜10 mL /分の速度で組織を連続的に灌流します。
- 561 nm発光フィルターによる落射蛍光法を使用して、台形体VNTBの腹側核における遺伝的に標識された内側オリボコクレアMOCニューロンを同定し、パッチクランプ記録を行います。パッチ適用可能なセルがない場合は、スライスを反転します。
- DIC光学系を使用して、スライスの厚い側の聴神経根に焦点を合わせ、マイクロマニピュレータを使用してバイポーラタングステン刺激電極を聴神経根まで下ろし、組織の表面に穏やかに移動します。
手記：吸引電極は、他の研究室の聴覚神経刺激実験で使用されてきました。シータガラス電極または光刺激法は、他の特定の調製物に適用可能な場合、採用することができる。 - 視野をVNTBに戻して、パッチクランプ電気生理学のターゲットとなるMOCニューロンを選択します。
- 記録ピペットに、提案された実験に適した内部溶液を入れます。
- 全細胞構成のMOCニューロンからパッチを当てて記録します。必要に応じて、膜の静電容量と直列抵抗を補償します。
- MOCニューロンで一貫したシナプス後イベントを得るために、聴覚神経根の電気刺激振幅を調整します
手記： 刺激電極を移動させる必要がある場合があります。 - 適切な刺激プロトコルを実行して、MOC(電圧クランプ)で誘発されたシナプス電流を観察します。
手記： ウェッジスライス調製は、ルースパッチ記録、薬理学、光遺伝学、カルシウムイメージング、神経伝達物質のアンケージングなど、あらゆる典型的なパッチクランプツールで使用できます。
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開示事項
利益相反は宣言されていません。
材料
| 名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
|---|---|---|---|
| A1R 正立共焦点顕微鏡 | ニコンインスツルメンツ | 電気生理学およびイメージング顕微鏡は、電気生理学と互換性のある任意の顕微鏡にすることができます | |
| 電極ホウケイ酸ガラス、フィラメント外径1.5mm、内径1.1mm、長さ10cm | サッターインストゥルメント | BF150-110から10 | パッチクランプピペットガラス |
| 電極充填機 MicroFil | WPIの | CMF20Gの | パッチ電極ピペットフィラー |
| インラインソリューションヒーター | ワーナー・インストゥルメンツ (GSAdvantage) | SH-27B型 | スライス灌流システムヒーター |
| マルチマイクロマニピュレーターシステム | サッターインストゥルメント | MPC-200 と MP285 | パッチクランプおよび刺激電極配置用のマイクロマニピュレーター |
| P-1000 ガラスマイクロピペット用横型ピペットプーラー | サッター機器 | FG-P1000 | パッチクランプピペッタープーラー |
| パッチクランプアンプとソフトウェア | ヘカ | EPC-10 / パッチマスター ネクスト | 任意のアンプ/ソフトウェアにすることができます |
| 録音チャンバー | ワーナー・インストゥルメンツ | RC26Gの | 録音中に「お風呂」をスライスする |
| レコーディングチャンバーハープ | ワーナー・インストゥルメンツ | 640253 | 電気生理学記録中にスライスを安定させます |
| Sliceインキュベーションチャンバー | カスタムビルド | スライス後の回収時にスライスするための加熱された酸素化された保持チャンバー | |
| 刺激アイソレーションユニット | A.M.P.I. | アイソフレックス | 電気生理学のための刺激遮断ユニット |
| シリンジ 60CC | フィッシャーサイエンティフィック(Intramalls) | 14-820-11 | 電気生理学灌流液の取り扱い |
| 温度コントローラー | ワーナー・インストゥルメンツ (GSAdvantage) | TC-324Cの | スライス灌流システム温度コントローラー |
| チューブ 1/8 OD 1/16 ID | フィッシャーサイエンティフィック(Intramalls) | 14*171*129 | 電気生理学灌流液の取り扱い |
| Tugsten同心円バイポーラ微小電極 | WPIの | TM33CCINS | 電気生理学のための刺激電極 |
