CA3-CA1シナプス応答のラット海馬スライスへの記録

要約

出典:Shetty, M. S. et al., げっ歯類からの急性海馬スライスを使用したシナプスタグ付け/捕獲およびクロスキャプチャの調査。J. Vis. Exp. (2015).

このビデオでは、ラットの海馬スライスでCA3-CA1シナプス応答を記録する方法を示します。海馬切片に刺激電極と記録電極を配置し、シナプス応答強度を評価するための電場興奮性シナプス後電位(fEPSP)を測定する手順を概説します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. CA3-CA1シナプス応答の記録

>注:電界電位記録に使用される電気生理学のセットアップを図1Aに示します。ファラデーケージは、電気設定を適切に接地した後に電気的干渉が制御を超えている場合は強く推奨されます。多くの異なるタイプの水中チャンバーと界面チャンバーが市販されています。しかし、界面チャンバーは、スライスがより堅牢なシナプス応答を示すため、好ましいとされています。

1. 電極の位置決め
   1. 使用する電気機器(刺激装置と amplifiers)。刺激電極と記録電極をマイクロマニピュレーターのプレキシガラスホルダーに取り付けて固定します。
      手記：刺激目的と記録目的の両方で、5MΩ抵抗のモノポーラ、ラッカーコーティング、ステンレス鋼電極を使用しています。
   2. 使用する前に、これらの電極を引っ張ったガラスキャピラリーの内側に挿入し、エポキシ接着剤で固定し、電極先端のごく一部のみを露出させます(図1E)。これにより、細い電極に強度が与えられ、電極ホルダーにしっかりと固定することができます。
   3. 顕微鏡下にガイドして、CA1領域の放射状層に刺激電極を配置して、シェーファー側副線維を刺激し、CA1の頂端樹状突起領域の記録電極を刺激して、フィールドEPSP(fEPSP)応答を記録します。
      手記：電極でスライスの上の液体表面に近づくと、スライスの表面をすばやく見つけるのに役立つ音が出ます(ただし、アンプがスピーカーに接続されている場合)。
   4. シナプスタグ付けおよびキャプチャ実験では、実験の必要性に応じて、記録電極の両側に2つまたは3つの刺激電極(S1、S2、またはS3)を配置して、2つ以上の独立したが重複する入力を刺激します。刺激電極と記録電極を約200μm離して配置します。
   5. 必要に応じて、人口スパイクを記録するために、錐体層層に別の記録電極を配置します(図2A)。両方の電極がスライスに接触したら、アクイジションソフトウェアを使用してテスト刺激を与え、適切なfEPSP信号を確認します。
      手記：試験刺激には、二相性定電流パルス(インパルス持続時間0.1ミリ秒/半波)を使用します。
   6. 適切なfEPSP信号が得られたら、マニピュレータの細かい移動ノブを使用して、電極を約200μmの深さまで慎重に下げます。スライスが回復するまで20分待ちます。
2. 入出力関係
   1. 電流強度の範囲で傾き値を測定することにより、各入力の入出力関係(求心性刺激とfEPSPの傾き)を決定します。これは、20 μAから100 μAの間で実行します。次に、各入力の刺激強度を設定して、最大fEPSPスロープの40%を取得します。実験全体を通してこれを一定に保ちます。
   2. 15〜20分後、ベースラインの記録を開始します。この期間中はfEPSPの傾きを注意深く監視し、傾きが設定値から10%以上変動した場合は刺激強度をリセットし、新しいベースラインを開始します。続行する前に、少なくとも 30 分または 1 時間の安定したベースラインを記録します。
      手記：テストまたはベースライン刺激では、5分ごとに0.2 Hzの二相性定電流パルス(極性あたり0.1ミリ秒)を4回スイープします。これら 4 つの応答の平均傾きは、1 回の繰り返しと見なされます。信号は差動アンプによってフィルタリングおよび増幅され、アナログ-デジタルコンバーターを使用してデジタル化され、カスタムメイドのソフトウェアでオンラインで監視されます。

結果

図 1.(A)刺激装置、(b)、差動増幅器、(c)アナログ-デジタルコンバータ、(d)、オシロスコープ、(e)取得ソフトウェア付きコンピュータ、(f)、耐振動性卓上型(g)、倍率>4倍、(h)インターフェース、ブレインスライスチャンバー、(i)ACSFおよびカルボゲン供給用灌流システム、(j)、温度コントローラ、(k)、照明源、(l)、電極ホルダー付きマニピュレータで構成されています。(B) 界面ブレインスライスチャンバー (C) & (D) 界面チャンバー内の海馬スライス (E) ガラスキャピラリーに密封されたステンレス鋼電極。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
I. ACSFコンポーネントケミカル
1. 塩化ナトリウム(NaCl)	シグマ・アルドリッチ	S5886
2.塩化カリウム(KCl)	シグマ・アルドリッチ	P9541
3. マグネシウム硫酸塩七水和物(MgSO4.7H20)	シグマ・アルドリッチ	M1880
4.塩化カルシウム二水和物(CaCl2.2H2O)	シグマ・アルドリッチ	C3881
5.リン酸カリウム一塩基性(KH2PO4)	シグマ・アルドリッチ	P9791
6. 重炭酸ナトリウム(NaHCO3)	シグマ・アルドリッチ	S5761
7. D-グルコース無水 (C6H12O6)	シグマ・アルドリッチ	G7021
II. 電気生理学機器
1.顕微鏡	オリンパス(日本)	モデルSZ61
2.温度コントローラー	Scientific Systems Design, Inc., カナダ	PTC03
3.差動ACアンプ	AMシステムズ、米国	モデル1700
4.アイソレートパルススティミュレーター	AMシステムズ、米国	モデル2100
5.オシロスコープ	ロード・シュワルツ	HM0722
6.デジタル-アナログコンバーター	Cambridge Electronic Design Ltd. イギリス・ケンブリッジ	CED-パワー1401-3
7.インターフェースブレインスライスチャンバー	Scientific Systems Design, Inc., カナダ	BSC01
8.チューブポンプ	Ismatec、Idex Health & Science、ドイツ	REGLO-アナログ
9. カルボゲン流量計	コール・パーマー	03220から44
10.ファイバーライトイルミネーター	ドーラン・ジェンナー・インダストリーズ	ファイバーライトMI-150
11.マイクロマニピュレーター	マルツハウザー・ヴェッツラー(ドイツ)	00-42-101-0000 (MM-33)
		00-42-102-0000 (MM-32)
12. 電極	AMシステムズ、米国	571000 (ステンレス鋼; 0.010, 5MΩ, 8°)

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