ショウジョウバエの感覚ニューロンからの生理応答の検出

1. サンプル調製

1. Gal4ドライバーラインをUAS-GCaMP5Gショウジョウバエメラノガスターフライ(w;P{20XUAS-IVS-GCaMP5G}attP40)。クロスを25°C.
   で成長させます 手記：Gal4またはUAS-GCaMP導入遺伝子の複数のコピーを持つハエを作製すると、蛍光シグナル強度を高めるのに役立ちます。UAS-GCaMP導入遺伝子(UAS-GCaMP3)の以前のバージョンは、Gr68a-Gal4ドライバーの制御下で発現した場合、非常に弱い蛍光強度を示しました。
   1. 新たに閉じた成虫のハエを性別で収集して分離し、25°Cで飼育します
      注:GCaMP5G蛍光のベースラインレベルは、14〜28日齢のハエに最適です。性別によってハエを隔離すると、神経反応に影響を与える可能性のある社会的相互作用の可能性が排除されます。
2. CO₂の穏やかな流れの下でハエを麻酔します。
3. 最初に0.17mmのカバースリップの中央にマニキュアを少し垂らして、フライをガラスのカバースリップに取り付けます。透明なマニキュアの滴の上にフライを横向きにそっと置き、フライがドロップ全体を覆うことを確認します。
4. 手順1.5と1.6を、8倍の倍率で使用した解剖実体顕微鏡で実行します。
5. 濡れた絵筆を使ってハエの前足を伸ばします。1番目と5番目の足根骨セグメントに2つの薄いテープを貼って、前脚を所定の位置に固定します(図1A)。これにより、足根骨セグメントT2-T4がイメージングのために露出します(図1B)。
6. 吻上のニューロンを画像化するには、吻の吻の上に薄いテープのストリップを置き、ラベルを露出させます(図1C、D)。
7. PAP(ペルオキシダーゼ-アンチペルオキシダーゼ)ペンでフライの周りに疎水性バリアを描き、溶液がカバーガラスの表面を流れるのを防ぎます。取り付け後30分以内に測定してください。

2. 刺激液の調製

1. PBST(Phosphate-Buffered Saline with Triton X-100)溶液中の希薄な親油性配位子(この研究で使用したCH₅0₃など):137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.8 mM KH₂PO₄、0.1% Triton X-100 (v/v)、pH 7.4。
   1. PBSTを使用して、リガンドの1 mg / mlストック溶液を調製します。PBST.
      を使用して、ストック溶液のその後のすべての希釈液を調製します 手記：目的の配位子の溶解度に応じて、それを溶解するために異なる溶媒が必要になる場合があります。表1は、さまざまな溶媒中のCH₅0₃の溶解度を示しています。他の溶媒とは異なり、PBSTは蛍光を増加させませんでした。

3. 味覚ニューロンの刺激と画像取得

1. 10 μlのピペッターを使用して、10 μlのPBSTを足根骨セグメントに置きます><。 手記：このステップにより、脚が湿り、足根骨の部分がドリフトするのを防ぎます。
2. 高い時間分解能で良好な蛍光信号を得るために、十分な速度と感度のカメラを備えた光学系を使用してください。
   手記： 本研究では、スピニングディスク共焦点顕微鏡とsCMOSカメラを使用しました(材料リスト参照)。
3. イメージングする特定の足根骨セグメントとニューロンを選択します。3つのプレスティミュレーション共焦点Zスタックを取得します。
   1. 理想的には、細胞体積全体をキャプチャしながら、最大限の時間分解能を可能にするのに十分な速度の取り込み設定を使用します。取得設定の例としては、200 msecの露光、2 x 2および6 x 0.5 μm2の光学セクションのビニング、2秒ごとに取得
      注:固定された脚は、30秒間隔で最大10分間正常に画像化されており、GCaMP信号の識別可能な漂白はありません。録音時間が長くなる場合は、脚がカバーガラスの所定の位置にしっかりと固定されていることを確認してください。
   2. レーザー出力を最適化して、イメージング領域全体で光退色を最小限に抑えながら、達成可能な最高の信号対雑音比を実現します。ここで説明する実験では、491 nmのダイオードレーザー(100 mW)を30%透過率で使用して、脚と吻のGr68aとppk23の両方の味覚ニューロンを画像化します。2 x 2 ビニングを使用して、十分な空間解像度を達成しながら、露光時間を短縮します。
      手記：レーザー出力の設定は、1.2倍から4.5倍までの増加幅の蛍光変化を検出するように最適化されました。
4. 刺激液10μlを足根骨セグメントにピペットで移します。コントロール実験用にPBSTをさらに10μl追加します。刺激後の画像を117枚すぐに取得
   手記：取得される刺激後の画像の数は、蛍光の最大変化(約 2 分)に達するのにかかった時間に基づいています。
   1. 重要なステップ:調製物で溶液をピペッティングするときは、前脚が位置から外れるため、ピペットの先端でフライに触れないでください。
      手記： あるいは、マイクロマニピュレーターを使用して、刺激を含むガラスキャピラリーを、イメージングする足根部の近くに正確に配置します。製造元の指示に従って、細胞内マイクロインジェクションディスペンサーを使用して制御された量の刺激を送達します。

図1:前脚またはテングニューロンのイメージングのためのライブフライの取り付け。(A)前脚の取り付け:生きたオスのハエの3.2倍の画像で、前脚がテープでカバーガラスに固定されていることを示しています。(B)フライの40倍画像は、足根部セグメント(T1〜5)のそれぞれと、第1足根部セグメントの上および第5足根セグメント上のテープの配置を示しています。(C)吻の取り付け:吻の先端を露出させるために、吻の上にテープを置きます。(D)刺激添加用のピペットチップはフライのわずかに上に保持されており、調製物に直接接触しません。

表1:CH503のさまざまな溶媒への溶解度。 DMSO:ジメチルスルホキシド。エタノール、ヘキサン、およびDMSO溶液をdH2O(v / v)で希釈しました。CH503 の 0.2% DMSO への溶解度は、250 ng/mL に限られていました。溶媒単独のΔF/Fの増加は、フェロモンによる刺激で観察された増加と同等でした。