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動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。
1. 手術
>注:閉ループ刺激の手術の正確な詳細は、使用される記録プローブの種類と対象とする脳領域によって異なります。ただし、ほとんどの場合、一般的な手術は次の手順で構成されます。
- ラットの入ったケージを手術室に持って行き、シリコンプローブまたは電極アレイを埋め込み、ニューロンの活動を記録します。
- げっ歯類を2〜2.5%イソフルランで麻酔し、頭部を定位固定装置フレームに固定します。軽度の触覚刺激に対する運動反応を観察することにより、手術中に動物が意識を失っていることを確認します。
- 手術中の乾燥を最小限に抑えるために、目の軟膏を塗布します。
- 手術部位を剃り、2%クロルヘキシジン溶液と70%イソプロピルアルコールで皮膚を消毒します。
- リドカイン(5 mg / kg)を頭皮の下に注入し、電極が埋め込まれる脳領域に注入します。.
- 将来のインプラントの領域で頭皮を切開し、メスと綿棒を使用して、露出した頭蓋骨から骨膜を取り除きます。
- 頭蓋骨に4〜8個の穴を開けて、インプラントの構造的支持体としてアンカースクリュー(~0.5mm)を埋め込みます。ネジを穴に挿入して頭蓋骨に取り付け、しっかりと固定されていることを確認します。
- 指定された座標で開頭術をドリルし、マイクロドライブ/プローブインプラントをはめ込みます.
手記：閉ループ刺激について記載されたプロトコルは、電極が挿入される任意の脳領域に対して機能する。
- マイクロドライブ/プローブと必要な電気インターフェースコネクタを歯科用アクリルを使用して頭蓋骨に固定します。歯科用アクリルの量は、インプラントをしっかりと取り付けるのに十分な量である必要がありますが、周囲の軟部組織に接触してはいけません。
- 手術後、動物が胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を注意深く監視します。その後の3日間は、鎮痛剤(メタカム1mg / kgなど)と抗生物質(エンロフロキサシン10mg / kgなど)を皮下投与します。.
手記：動物は通常、手術から回復するために、検査や記録の1週間前に放置されます。
2. ソフトウェアのインストール
>注:これはWindows 10、64ビットバージョンでテストされました。
- データ集録および処理ソフトウェアをインストールします。
- Cheetah Acquisition Systemと対話するためのライブラリを含むデータ収集システムCheetah 6.4(https://neuralynx.com/software/category/sw-acquisition-control)をインストールします。
- SpikeSort3D(https://neuralynx.com/software/spikesort-3d)またはスパイクソートにKlustaKwik27を使用するその他のソフトウェアをインストールします。オンライン検出ソフトウェアは、KlustaKwik エンジンのクラスター定義を使用します。本ソフトウェアは、同じネットワーク上の同じコンピュータ上または別々のコンピュータ上で実行される場合があります。
- NetComDevelopmentPackage(https://github.com/leomol/cheetah-interface/blob/master/NetComDevelopmentPackage_v3.1.0)をインストールします。これは https://neuralynx.com/software/netcom-development-package からもダウンロードできます。
- Matlabをインストールします(https://www.mathworks.com/downloads/;コードはMatlabバージョンR2018aでテストされました)。MatlabがWindowsファイアウォールで有効になっていることを確認してください。通常、最初の接続時にポップアップが表示されます。
- Matlabアカウントにログインします。ライセンスを選択します。バージョンを選択します。オペレーティングシステムを選択します。
- https://github.com/leomol/cheetah-interface からオンラインイベントトリガー用の次のライブラリをダウンロードし、ファイルをコンピューターの「Documents / Matlab」フォルダに抽出します。コードのコピーは、付属の補足資料に記載されています。
3. 初期データ取得
- Cheetahソフトウェアを使用してデータ取得を開始します。
- 数分間のスパイクデータを記録して、テンプレート波形に入力します。
- データ集録を停止し、記録されたデータに対してスパイクソートを実行します。
- SpikeSort3Dを開き、[ファイル]|メニュー |Spike Fileをロードし、記録されたデータがあるフォルダからspike fileを選択します。
- 「Cluster Menu」をクリックし、「Autocluster using KlustaKwik」をクリックし、デフォルト設定のままにして「Run」をクリックします。
4. 閉ループ実験
- Cheetahでデータ取得を再開します。
- Matlabを開きます。
- ClosedLoop.mを開き、「Run」をクリックします。または、Matlab コマンド ウィンドウで ClosedLoop() を実行します。ClosedLoop.m が Matlab パス上にあることを確認します。ユーザーがカスタム関数を使用してすべてのトリガーを呼び出す場合は、代わりに ClosedLoop('-callback', customFunction) を実行します (customFunction はその関数のハンドルです)。
- 最初の録音で定義されたスパイク情報をロードするには、[ロード]をクリックし、録音フォルダを参照して、スパイクデータファイル(.ntt、.nse)の1つを選択します。
- プロットされた波形の下のチェックボックスをクリックして、刺激をトリガーする1つまたは複数のニューロンを選択します。
- 「min matches」テキストボックスに整数を入力して、刺激をトリガーするニューロンの最小数を定義します。次に、異なる波形に一致するスパイクが共アクティブと見なされるタイムウィンドウを定義するには、[window]テキストボックスに数値を入力します。
- [Send to start] をクリックします。これにより、選択したニューロンのスパイク活動に基づくイベント(デフォルトではトーン)のオンライントリガーが開始されます。