ラット脳切片におけるシナプスイベントの光遺伝学的刺激と電気生理学的記録

要約

出典:Kinnavane, L., et al.> Ex Vivo Optogenetic Interrogation of Long-Range Synaptic Transmission and Plasticity from Medial Prefrontal Cortex to Lateral Entorhinal Cortex.J. Vis. Exp.(2022年度)

このビデオは、内側前頭前野(mPFC)軸索を光遺伝学的に刺激し、LECの錐体ニューロンの応答を記録することにより、外側嗅内皮質(LEC)のシナプス効率を研究する手順を示しています。この方法は、パッチクランプ記録と光刺激によるシナプス活性化を組み合わせて、シナプスの可塑性を研究するものです。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 電気生理学と光遺伝学的刺激

1. 標的細胞の同定。
   1. スライスを、蠕動ポンプにより人工脳脊髄液(aCSF)を2 mL/minの速度で灌流した34°Cの水中記録チャンバーに入れます。スライスアンカーを使用してスライスを固定します。
   2. 斜め赤外線照明を使用した広視野顕微鏡の低倍率(4倍)の対物レンズの下で、外側嗅内皮質(LEC)層5に移動します。ピアルサーフェスから必要なレイヤーまでの距離を測定します。
      手記：斜め赤外線照明は、記録室のカバーガラスから約3mm下に近赤外線LEDをカバーガラスの平面に対して~55°の角度で配置することで実現しました(図1B)。微分干渉コントラストは、スライスの電気生理学のための代替および一般的に使用されるイメージング技術です。
   3. 高倍率の水浸対物レンズ(40倍)に変更し、錐体ニューロンを特定します。コンピュータモニタ上のセルの位置をテープでマークします。
      手記：錐体ニューロンは、スライスの軟膜表面に向かって突出する顕著な頂端樹状突起を持つほぼ三角形の形態を有する(図2A)。細胞の健康状態は、凝縮した目に見える核がないことと、滑らかに見えるはずの原形質膜の検査によって評価できます。広視野蛍光顕微鏡を使用すると、オプシン-フルオロフォア融合タンパク質による軸索の明確な蛍光標識が見える可能性は低いです。軸索突起を可視化するには、オプシンの蛍光色素に対する一次抗体を使用して免疫組織化学を事後的に行い、同じまたは類似の波長の蛍光色素に結合した二次抗体で増幅します。
2. 全細胞パッチクランプの形成。​
   1. ピペットプーラーを使用してホウケイ酸ガラスマイクロピペットを作製し、ろ過された細胞内記録溶液(120 mM k-グルコン酸、40 mM HEPES(N-2-ヒドロキシエチルピペラジン-N'-2-エタンスルホン酸)、10 mM KCl(塩化カリウム)、2 mM NaCl(塩化ナトリウム)、2 mM MgATP(マグネシウムアデノシン三リン酸)、1 mM MgCl(塩化マグネシウム)、0.3 mM NaGTP(グアノシン三リン酸ナトリウム)、0.2 mM EGTA(エチレングリコール四酢酸)、 UPW(超純水、pH 7.25、285-300 mOsm)で作られた0.25%ビオシチン)。充填したマイクロピペットをパッチクランプアンプヘッドステージの電極ホルダーに置き、電極ワイヤーが細胞内溶液に接触していることを確認します。
   2. 電極ホルダー側ポートにチューブで接続したマウスピース(プランジャーを取り外した1mLシリンジなど)に強く息を吹き込んで口圧を加え、インライン三方弁を閉じて圧力を維持します。半月板が形成されるように顕微鏡の対物レンズを持ち上げ、顕微鏡で見えるようになるまで電極を半月板に挿入します。
   3. WinLTP16(またはその他のアクイジション・ソフトウェア/オシロスコープ)でシール・テスト・ウィンドウを開き、アンプを電圧クランプ・モードにして、5mVの方形パルスを印加し、ピペット抵抗が3〜6MΩかどうかを判断します。
   4. 同定された細胞に近づき、ピペットチップで触れると、細胞膜にくぼみが生じ(図2A、右パネル)、ピペット抵抗がわずかに増加します(0.1MΩ)。
   5. 正圧を放ち、マウスピースで適度な吸引を加えて負圧を加えると、ピペット抵抗が大幅に増加します(>1000MΩ)。圧力をニュートラルのままにできるようになりました。細胞膜が破裂して全細胞容量が一時的に発生するまで、徐々に増加するランプで負圧を加えます。
3. 光遺伝学的に誘発されたシナプスイベントを記録します。
   1. 電流クランプ構成を入力します。
      注:ほとんどの場合、長距離シナプス伝達はグルタミン酸作動性であるため、塩化物反転電位に近い膜電位で記録すると、AMPA受容体(AMPAR)を介した伝達が最適に分離され、誘発されるフィードフォワード阻害(FFI)の測定が最小限に抑えられます。塩化物反転は、細胞内記録溶液とaCSFの組成に依存し、ゴールドマン・ホジキン・カッツ方程式を使用して計算できます。上記のソリューションでは、これは -61.3 mV でした。第5層LEC錐体ニューロンの平均静止膜電位は-62mVであり、必要に応じて、定電流の注入によってこの電位に維持されました。あるいは、セルを所望の電位に電圧クランプすることもできます。長距離抑制性投射を記録する16、またはFFIを記録するには、陽イオン反転電位での電圧クランプにより、GABA作動性塩化物コンダクタンスを分離します。膜電位が活動電位閾値を超えるニューロンで電位クランプニューロンをクランプする場合、電位依存性ナトリウムチャネル遮断薬を含むセシウムベースの細胞内溶液を使用して電圧クランプを改善し、活動電位の開始を防ぎます(130 mM CsMeSO4(メタンスルホン酸セシウム)、10 mM HEPES、8 mM NaCl、5 mM QX 314塩化物、4 mM MgATP、0.5 mM EGTA、0.3 mM NaGTP、0.25%バイオシチン、UPW製、 pH 7.25、285-300 mOsm)。
   2. データ集録ソフトウェアを使用して、トランジスタ-トランジスタロジック(TTL)信号をLED(発光ダイオード)ドライバに送信し、取り付けられた470nm LEDをアクティブにします。取り付けられたLEDは、フィルターキューブと適切な光学系(図1B)を使用して顕微鏡の光路に向けられ、40倍対物レンズを介してスライスに光パルスを印加し、光遺伝学的興奮性シナプス後電位(oEPSP)を呼び起こします
      手記：光パルスは、樹状突起上/樹状突起上に加えることができ、その結果、軸索およびシナプス前ボタンのオプシンが活性化されます。または、研究者は、オーバーブートン刺激を避けるために、記録された細胞から離れた軸索に対物レンズを移動させることができます。oEPSPの最大振幅は、シナプス投射の強度、ウイルス注射の有効性、および使用されるオプシンによって異なります。oEPSPは、光強度および/または持続時間を変えることにより、所望の振幅に滴定することができる18;光パルスの持続時間を変化させると(通常、LEDの最大出力で0.2〜5ミリ秒の持続時間、光密度は4.4 mW/mmになります19)、LEDの電力出力を変更するよりも一貫したoEPSP振幅が得られます。
   3. シナプス前放出特性(電圧の変化)は、刺激間間隔が異なる複数の光パルスの列を送達することによって調査する(図2E);光遺伝学的に誘発された伝達を解釈する際には注意が必要である。
   4. oEPSPs19を繰り返し誘発するか、リガンドを応用することにより、長期的な可塑性を調査します。oEPSPの振幅を5〜10分間監視して、可塑性の誘導前に安定性を確保し、その後、安定した振幅に達するまで監視します(通常は30〜40分)
      手記：現在のほとんどのオプシンは、LTPを誘導するために一般的に使用されるような、100Hzで100回の刺激を送達するなど、高周波で複数の活動電位を確実に誘発することができません。
   5. oEPSPがモノシナプスであることを確認するには、対物レンズを樹状突起上に配置し、0.5 μMテトロドトキシンと100 μMアミノピリジンの存在下で刺激することにより、形質導入経路のオーバーブートン活性化を行います。テトロドトキシンの適用は、応答が活動電位依存性である場合、伝達を消失させ、その後のアミノピリジンの包含は、oEPSPが単シナプス的に生成される場合、伝達を部分的に回復させる19,20。
   6. バイオサイトンがニューロンを満たすようにするには、全細胞構成に入ってから少なくとも15分間待ちます。電圧クランプでは、膜の静電容量と入力抵抗を監視します。
   7. 細胞の体細胞から離れるアプローチ角度に沿ってピペットをゆっくりと引き抜き、静電容量過渡現象と膜電流のゆっくりとした消失を観察し、細胞膜の再シールとピペット先端に外側外側のパッチが形成されることを示します。スライスの向きとスライス内のセルの位置に注意してください。スライスを24ウェルプレートのPFA(パラホルムアルデヒド)に入れ、4°Cで一晩インキュベートした後、0.1 M PB.
      に移します。 手記：スライスは最大1週間保存できます。より長い保管が必要な場合は、PB(リン酸緩衝液)を定期的に交換するか、アジ化ナトリウム(アジ化ナトリウムの0.02%〜0.2%)を含むPBを使用してください。

結果

図1:全細胞記録の可視化、光遺伝学的興奮、tdTomato陽性ニューロンの同定のためのスライスコレクションチャンバーと光学的構成。(A)スライス収集チャンバー14は、ナイロンメッシュのシートに接着された微量遠心チューブラックからカスタムメイドされ、ビーカーに入れられ、CSFに沈められます(B)ChR2(チャネルロドプシン-2)(470nm)およびtdTomato(565nm)の励起のためのLEDは、非球面コンデンサーレンズを通して光をコリメートするために導かれ、565nmの光はバンドパスフィルターを通して照射され、tdTomato励起および発光スペクトルのスペクトル分離を達成します。これらはロングパスダイクロイックミラーと組み合わされ、より長い波長の2番目のロングパスダイクロイックミラーでスライスに向けられます。次に、対物レンズ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3ウェイルアーバルブ	コール・パーマー	WZ-30600-02
40倍対物レンズ	オリンポス	LUMPLFLN40XW
4-アミノピリジン	こんにちはバイオ	HB1073
4倍対物レンズ	オリンポス	PLN4X/0.1
アクロマティックレンズ	エドモンド・オプティクス	49363	視覚スペクトルと近赤外に焦点を合わせる
卓上マイクロ遠心分離機	ベンチマーク・サイエンティフィック	C1005※
ビオシチン	シグマ・アルドリッチ	B4261
ホウ珪酸ガラスキャピラリー	ワーナー・インストゥルメンツ	G150F-6
CaCl2	シグマ・アルドリッチ	C5670
カメラ - Qimaging Retiga Electro	フォトメトリクス	01-エレクトロ-M-14-C
カルバチョル	トクリス	2810
クロルヘキシジン外科用スクラブ	ベタセプト	XHG008
バリカン	アンディス	22445	AGCスーパー2速着脱式ブレードクリッパー
コリメーションコンデンサーレンズ	トールラボ	ACL2520-A
カバースリップ	フィッシャーサイエンティフィック株式会社	10011913
クライオスタット	ライカ	CM3050 Sの
CsMeSO4	シグマ・アルドリッチ	C1426
シアノアクリレート接着剤	ラピッドエレクトロニクス株式会社	〒84-4557
データ取得装置	ナショナルインスツル	USB-6341 BNC対応
D-グルコース	シグマ・アルドリッチ	G8270
ダイクロイックミラー 500nm ロングパス	エドモンド・オプティクス	69899
ダイクロイックミラー 600nm ロングパス	エドモンド・オプティクス	69901
ダイクロイックミラーキューブ	トールラボ	CM1-DCH/M
エグタ	ミルポア	324626
サイドポート付き電極ホルダー	ヘカ	895150
発光フィルター	彩度	59022メートル
励起フィルタ	彩度	ET570/20倍
アイジェル	デクラ	ルブリタール
細いペイントブラシ	科学実験用品	BRU2052
ギロチン	世界の精密機器	DCAPの
ヘープス	シグマ・アルドリッチ	H3375-J
過酸化水素溶液	シグマ・アルドリッチ	H1009	30% (幅/週)
イソフルラン	ヘンリー・シャイン	〒988-3245
イソペンタン	シグマ・アルドリッチ	M32631
KClの	シグマ・アルドリッチ	P3911
K-グルコン酸	シグマ・アルドリッチ	G4500
キネマティック蛍光フィルターキューブ	トールラボ	DFM1T1
LEDドライバー	トールラボ	LEDD1Bの
MgATPの	シグマ・アルドリッチ	A9187の
MgCl	シグマ・アルドリッチ	M2670
MgSO4	シグマ・アルドリッチ	M7506
微小電極プーラー	サッター機器	P-87
マイクロインジェクションシリンジ	ハミルトン	7634-01/00
マイクロインジェクションシリンジニードル	ハミルトン	7803-05	カスタム仕様:ゲージ33、長さ15mm、ポイントスタイル4-12°
マイクロインジェクションシリンジポンプ	世界の精密機器	UMP3T-1
青色LED搭載	トールラボ	M470L5
Na2HPO4.7H2O	シグマ・アルドリッチ	S9390
NaCl	シグマ・アルドリッチ	S9888
NaGTPの	シグマ・アルドリッチ	G8877
NaH2PO4	シグマ・アルドリッチ	S0751
NaH2PO4.H2O	シグマ・アルドリッチ	S9638
NaHCO3	シグマ・アルドリッチ	S5761
近赤外LED	オスラム	SFH4550	スライスの屈折IRイメージングに使用される微分干渉コントラスト(DIC)光学系は、別の一般的に使用される方法です
パラホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	158127
パラホルムアルデヒド	シグマ・アルドリッチ	P6148
パッチクランプアンプ	分子デバイス	700エー
蠕動ポンプ	世界の精密機器	ミニスター
ポリ-L-リジンコーティング顕微鏡スライド	フィッシャーサイエンティフィック株式会社	23-769-310
録音室	ワーナー・インストゥルメンツ	RC-26Gの
スライスアンカー	ワーナー・インストゥルメンツ	SHD-26-GH/15
マイクロドリル用脳定位固定装置ホルダー	ハーバード大学装置	75-1874
蔗糖	シグマ・アルドリッチ	S0389
手術用顕微鏡	カールツァイス	OPMI 1 FRプロ
細胞内記録液用シリンジフィルター	Thermo Scientific Nalgene	〒171-0020
正立型蛍光顕微鏡	ライカ	DM6 B
解決
aCSFの
ショ糖切断ソリューション
PFAの