ショウジョウバエ幼虫神経細胞における微小電極媒介FM色素のローディングとアンローディング

要約

出典:Kopke, D. L., et al., FM dye cycling at the synapse: comparing high potassium depolarization, electrical and channelrhodopsin stimulation. J. Vis. Exp. (2018)

この動画では、ショウジョウバエの幼虫の神経線維をFM色素に浸し、細胞膜脂質に結合させています。吸引された微小電極と電気パルスはエンドサイトーシスプロセスを刺激し、FM色素を新しく形成されたエンドサイトーシス小胞に組み込みます。この方法は、神経伝達のシナプス前段階を可視化するもので、シナプス機能や神経伝達物質の放出を研究するのに役立ちます。

プロトコル

1. 幼虫の接着剤の解剖

1. シリコーンエラストマーベース10部とエラストマーキットのシリコーンエラストマー硬化剤1部を完全に混合します。
2. 22 x 22 mmのガラスカバースリップにエラストマーをコーティングし、75°Cのホットプレートで数時間硬化させます(手触りがベタつかなくなるまで)。
3. エラストマーでコーティングされたガラスカバースリップを1枚、カスタムメイドのプレキシガラス解剖チャンバーに入れて、幼虫を解剖します。
4. 標準的な微小電極プーラーを使用してホウケイ酸ガラスキャピラリーから接着剤ピペットを調製し、目的のテーパーとチップサイズを取得します。
5. マイクロピペットの先端をそっと折って、もう一方の端に2フィートの柔軟なプラスチックチューブを取り付けます(内径1/32インチ、内径3/32インチ、外径3/32インチ、外径1/32インチ、壁1/32インチ、マウスフィッティング付き(P2ピペットチップ)。
6. 幼虫の解剖の準備として、小さな容器(0.6 mL Eppendorfチューブキャップ)に少量(~20 μL)の接着剤を入れます。
7. 128 NaCl、2 KCl、4 MgCl₂、1 CaCl₂、70スクロース、および5 2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸(HEPES)pH 7.2)を生理食塩水(mM)でチャンバーに充填します。
8. Alexa Fluor 647に結合した抗ウマダイサビペルオキシダーゼ(HRP)抗体(抗HRP:647;1 mg / mLストックから1:10に希釈)を添加して、解剖中にNMJシナプス前末端を標識します21,22。
9. 細い絵筆(サイズ2)を使用して、さまよう3番目のインスターを食品バイアルから取り出し、エラストマーコーティングされたカバーガラスの上に置きます。
10. ガラスマイクロピペットの先端に、アタッチメントを取り付けた口から発生する負圧を使用して、少量の接着剤を充填します(ステップ1.5)。
11. 幼虫の背側を上にして鉗子で配置し、口からの陽圧を使用して、少量の接着剤でエラストマーコーティングされたカバースリップに頭を接着します。
12. 幼虫の後端でこの手順を繰り返し、動物が2つの接着剤アタッチメントの間でぴんと張っていることを確認します。
13. ハサミ(刃3mm)を使用して、後部に水平(~1mm)の切り込みを入れ、背側の正中線に沿って全体に垂直に切り込みを入れます。
14. 細い鉗子(#5)を使用して、背側の気管、腸、脂肪体、および筋肉組織を覆っている他の内臓をやさしく取り除きます。
15. 4つのボディウォールフラップに対して接着手順を繰り返し、ボディウォールを水平および垂直にゆっくりと伸ばします。
16. 鉗子を使って腹側神経索(VNC)を持ち上げ、ハサミで運動神経を丁寧に切ってから、VNCを完全に取り除きます。
17. SVサイクリングを停止するには、解剖生理食塩水をCa²⁺フリー生理食塩水(CaCl₂を含まない上記の解剖生理食塩水と同じ)に交換します。

2. 電気刺激FM染料の装填

1. 微小電極プーラーを使用して吸引ピペットを準備し、必要なテーパーとチップサイズを取得します。
2. 微小電極の先端をマイクロ鍛造でファイヤーポリッシュし、単一の運動神経がしっかりと吸い上げられる
まで磨きます。
3. 吸引ピペットをマイクロマニピュレーターの電極ホルダーにスライドさせ、長くて柔軟なプラスチックチューブとシリンジに取り付けます。
4. スティミュレータパラメータを設定します(例:15 V、20 Hz周波数、20 ms持続時間、5分または1分)。
5. 幼虫調製物中のCa²⁺フリー生理食塩水を、電気生理学装置内の上記のFM1-43生理食塩水(4 μM; 1 mM CaCl₂)と交換します。
6. 調製物を顕微鏡ステージに置き、幼虫と吸引ピペットが焦点が合うまでステージを上げます(40倍水浸対物レンズ)。
7. シリンジによって生成された負圧で、選択した半節を神経支配する切断された運動神経のループを吸引電極に吸い込みます。
8. 選択した半セグメントの筋肉収縮を視覚的に監視しながら、短い刺激で吸引電極の機能をテストします。
9. 選択したパラメーター (ステップ 2.4) を使用して運動神経を刺激し、SV エンドサイトーシスと FM1-43 色素の取り込みを促進します。
10. Ca²⁺フリー生理食塩水(5回×1分間)で素早く洗浄し、FM1-43色素溶液を完全に除去します。
11. 幼虫の準備を新鮮なCa²⁺フリー生理食塩水で維持し、上からの共焦点イメージングプロトコルを使用して即時イメージングします。
12. NMJ画像(セグメント、サイド、マッスル)に注意して、FM色素のアンロード後に同じNMJにアクセスできるようにします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
SylGard 184 シリコンエラストマーキット	フィッシャーサイエンティフィック	NC9644388	解剖用のカバーガラスに貼る
顕微鏡カバーガラス22x22-1	フィッシャーブランド	12-542-B	SylGardを解剖のために装着すること
アルミトップホットプレート 2200形	サーモリン	HPA2235M	シルガードを治すために
プレキシガラス解剖室	該当なし	該当なし	手作り
ホウケイ酸ガラスキャピラリー	WPIの	1B100F-4	吸引および接着剤マイクロピペットを作るには
レーザーベースのマイクロピペットプーラー	サッターインストゥルメント	P-2000	吸引および接着剤マイクロピペットを作るには
タイゴンE-3603実験用チューブ	コンポーネントサプライ株式会社	テト-031A	口と吸引のピペット用
P2ピペットチップ	USAサイエンティフィック	〒1111-3700	マウスピペット用
0.6 mL Eppendorfチューブキャップ	フィッシャーサイエンティフィック	05-408-120	解剖のために接着剤を入れるために使用されます
ベトボンド3M	WPIの	ベトボンド	解剖に使用する接着剤
塩化カリウム	フィッシャーサイエンティフィック	P-217	フォーサリン
塩化ナトリウム	ミリポアシグマ	S5886	生理食塩水用
塩化マグネシウム	フィッシャーサイエンティフィック	M35-500	生理食塩水用
塩化カルシウム二水和物	ミリポアシグマ	C7902	生理食塩水用
蔗糖	フィッシャーサイエンティフィック	S5-3	生理食塩水用
ヘープス	ミリポアシグマ	H3375-J	生理食塩水用
HRP:アレクサフロー647	ジャクソン免疫研究	〒123-605-021	神経膜の標識
絵筆	ウィンザー&ニュートン	94376864793	幼虫を操作するには
デュモンデュモスターピンセット #5	WPIの	500233	解剖時に使用
7 cm McPherson-Vannasマイクロハサミ(ブレード3 mm)	WPIの	14177	解剖時に使用
FM1-43	フィッシャーサイエンティフィック	T35356	蛍光スチリル染料
デジタルタイマー	VWRの	62344から641	FM染料のロード/アンロードのタイミングに
マイクロフォージ	WPIの	MF200	ポリッシュガラスマイクロピペットの焼成
20mLシリンジスリップチップ	BDの	301625	電気刺激のために軸索を吸い上げるため。
マイクロマニピュレーター(磁気ベース)	成茂	MMN-9	電気刺激のための吸引電極を制御するため
刺激	草	S48	LEDと電気刺激を制御する
Zeiss Axioskop 顕微鏡	ツァイス		電気刺激中に使用されます。
40X Achroplan 水浸対物レンズ	ツァイス		電気刺激および共焦点イメージング中に使用
カメラポート付きZeiss Stemi Microscope	ツァイス	2000年C月	チャネルロドプシン刺激中に使用
T-Cube LEDドライバー	トールラボ	LEDD1Bの	LEDを制御するには
LED電源	シンコンエレクトロニクス株式会社	TR15RA150	LEDに電力を供給するには
光パワー&エネルギーメーター	トールラボ	PM100Dの	LEDの強度を測定するには