ショウジョウバエ幼虫におけるシナプス小胞のリサイクルと蛍光色素の取り込みの解析

要約

出典:Kopke, D. L., et al., FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp.(2018年)。

このビデオは、チャネルロドプシンを発現するショウジョウバエの幼虫の神経筋接合部でのシナプス小胞のリサイクルを蛍光色素を使用して研究するプロトコルを示しています。青色光はチャネルロドプシンを活性化し、カルシウムの流入とシナプス小胞のエキソサイトーシスを引き起こします。この色素は神経膜に組み込まれ、エンドサイトーシス中に内在化されるため、蛍光が増強されます。さらにブルーライト刺激を受けると、エキソサイトーシスと色素の放出が誘発され、これは蛍光の減少によって示されます。

プロトコル

1. 幼虫の接着剤の解剖

1. シリコーンエラストマーベース10部とエラストマーキットのシリコーンエラストマー硬化剤1部(材料表)を十分に混合します。
2. 22 x 22 mmのガラスカバースリップにエラストマーをコーティングし、75°Cのホットプレートで数時間硬化させます(手触りがベタつかなくなるまで)。
3. エラストマーでコーティングされたガラスカバースリップを1枚、カスタムメイドのプレキシガラス解剖チャンバー(図1、下)に入れて、幼虫の解剖に備えます。
4. 標準的な微小電極プーラーを使用してホウケイ酸ガラスキャピラリーから接着剤ピペットを調製し、目的のテーパーとチップサイズを取得します。
5. マイクロピペットの先端をそっと折らし、もう一方の端に2フィートの柔軟なプラスチックチューブ(内径1/32インチ、内径3/32インチ、外径3/32インチ、外径1/32インチの壁)を取り付けます。資料表)マウスフィッティング付き(P2ピペットチップ)。
6. 幼虫の解剖に備えて、小さな容器(0.6 mL Eppendorfチューブキャップ)に少量(~20 μL)の接着剤(材料表)を入れます。
7. 128 NaCl、2 KCl、4 MgCl₂、1 CaCl₂、70スクロース、および5 2-[4-(2-ヒドロキシエチル)ピペラジン-1-イル]エタンスルホン酸(HEPES)pH 7.2)を生理食塩水(mM)でチャンバーに充填します。
8. Alexa Fluor 647に結合した抗ホースダイディッシュペルオキシダーゼ(HRP)抗体(抗HRP:647、1 mg/mLストックから1:10に希釈)を添加し、解剖中に神経筋接合部(NMJ)のシナプス前末端を標識します。
9. 細い絵筆(サイズ2)を使用して、さまよう3番目の幼虫をフードバイアルから取り出し、エラストマーでコーティングされたカバーガラスに置きます。
10. ガラス製マイクロピペットチップに、アタッチメント付きの口から発生する負圧を使用して、少量の接着剤を充填します(ステップ1.5)。
11. 鉗子で幼虫の背側を上にして配置し、口からの陽圧を使用して、エラストマーでコーティングされたカバースリップに頭を少量の接着剤で接着します。
12. 幼虫の後端でこの手順を繰り返し、動物が2つの接着剤アタッチメントの間でぴんと張っていることを確認します。
13. はさみ(刃3 mm;Table of Materials)では、後部に水平にカット(~1 mm)し、背側の正中線に沿って全体に垂直にカットします。
14. 細い鉗子(#5、材料表)を使用して、背側の気管、腸、脂肪体、および筋肉組織を覆っている他の内臓をやさしく取り除きます。
15. 4つの体壁フラップの接着手順を繰り返し、体壁を水平と垂直の両方に優しく伸ばすようにします。
16. 鉗子を使って腹側神経索(VNC)を持ち上げ、運動神経をハサミで丁寧に切ってから、VNCを完全に取り除きます。
17. 解剖生理食塩水をCa²⁺-遊離生理食塩水(CaCl₂を含まない上記の解剖生理食塩水と同じ)に交換して、シナプス小胞(SV)サイクリングを停止します。

2. イメージング:共焦点顕微鏡

1. 40倍水浸対物レンズを備えた正立共焦点顕微鏡を使用して、NMJ色素蛍光をイメージングします(他の顕微鏡も使用できます)。
2. 腹部セグメント2-4のNMJ4を画像化し(他のNMJも撮像可能)、適切なソフトウェアを用いて画像を収集します(Table of Materials)。
3. HeNe 633 nmレーザーを使用してHRP:647を励起し(ロングパスフィルター>635 nmを使用)、Argon 488 nmレーザーを使用してFM1-43を励起します(バンドパスフィルター530-600 nmを使用)。
4. 両方のチャネルの最適なゲインとオフセットを運用上決定します。
   手記：これらの設定は、実験の残りの部分を通じて一定に保たれます。
5. シナプス終末のHRPマーク付きの上部から下部まで、選択したNMJ全体を通して共焦点Zスタックを取ります。
6. 画像化されたNMJ(セグメント、サイド、筋肉)に注意して、FM染料のアンロード後にまったく同じNMJに過剰になるようにします。

3. チャネルロドプシン刺激FM色素の装填

1. ChR2 を発現する幼虫を、ChR2 補因子オールトランス レチナール (エタノールに溶解、最終濃度 100 μM) を含む食品で飼育します。
2. 幼虫の準備物を、カメラポートを備えた解剖顕微鏡ステージ上のプレキシガラスチャンバーに入れます。
3. 青色LED(470nm;資料表)同軸ケーブルを使用してプログラム可能な刺激装置に接続し、LEDをカメラポートに配置します。
4. 顕微鏡ズーム機能を使用して、青色LED光ビームを解剖された幼虫機能に焦点を合わせます。
5. 幼虫調製物のCa²⁺フリー生理食塩水を、光遺伝学的段階で上記のFM1-43生理食塩水(4μM;1 mM CaCl₂)に交換します。
6. 刺激装置を使用してLEDパラメータを設定します(例:15 V、20 Hzの周波数、20 msの持続時間、5分の時間（図2))。
7. 光刺激を開始し、光遺伝学的刺激期間の所定の期間(例:5分;図 2)。
8. タイマーが止まったら、すぐにFM染料溶液を取り出し、^Ca2+フリー生理食塩水と交換してSVサイクリングを停止します。
9. Ca²⁺フリー生理食塩水(5回で1分間)ですばやく連続して洗浄し、FM色素溶液が完全に除去されていることを確認します。
10. 幼虫の準備を新鮮なCa²⁺フリー生理食塩水で維持し、イメージングプロトコルを使用して共焦点顕微鏡ですぐにイメージングします。
11. 画像化されたNMJ(セグメント、サイド、筋肉)に注意して、FM染料のアンロード後にまったく同じNMJにアクセスできるようにします。

4. チャネルロドプシン刺激:FM染料のアンロード

1. Ca²⁺を含まない生理食塩水を、幼虫に焦点を合わせたカメラポートLEDを備えた解剖顕微鏡ステージで通常の生理食塩水(FM1-43色素なし)に交換します。
2. アンロード用のスティミュレータパラメータを設定します(例:15 V、20 Hzの周波数、20 msの持続時間、2分間の時間（図2)。
3. 光刺激を開始し、光遺伝学的刺激期間の所定の期間(例:2分;図 2)。
4. タイマー期間が終了したら、FM染料溶液を迅速に取り除き、Ca²⁺フリー生理食塩水と交換してSVサイクリングを停止します。
5. Ca²⁺フリー生理食塩水(5回×1分間)で素早く連続して洗浄し、外部染料が完全に除去されていることを確認します。
6. 幼虫の準備を新鮮なCa²⁺フリー生理食塩水で維持し、共焦点顕微鏡ですぐにイメージングします。
7. FM1-43色素の蛍光は、上記と同じNMJで、同じ共焦点設定を使用してイメージングしてください。

結果

図1:ショウジョウバエNMJでのFM1-43色素ローディングプロトコルのフローチャート。幼虫の接着剤解剖は、腹側神経索(VNC)が腹側正中線(Vm)から半分節的に繰り返される体壁筋アレイに分節神経を投影する、平坦化された神経筋組織の準備を生成します(ステップa)。VNCを切断してフリーにし、その後、幼虫の全解剖液をピンク色のFM1-43溶液(4 μM)でインキュベートして刺激に備えます(ステップb)。次に、FM1-43に選択された刺激パラダイムがロードされます(ステップ3)。幼虫全体の高[K+]脱分極(cI)、単一の運動神経の吸引電極刺激(cII)、または高度に標的化されたチャネルロドプシン(cIII)の光駆動活性化のオプションがあります。FM1-43の取り込みは、Ca2+を含まない生理食塩水と色素を充填したNMJを画像化して停止します(ステップd)。次に、FM1-43を浴中で使用せずに2回目の...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
SylGard 184 シリコンエラストマーキット	フィッシャーサイエンティフィック	NC9644388	解剖用のカバーガラスに貼る
顕微鏡カバーガラス22x22-1	フィッシャーブランド	12-542-B	SylGardを解剖のために装着すること
アルミトップホットプレート 2200形	サーモリン	HPA2235M	シルガードを治すために
プレキシガラス解剖室	該当なし	該当なし	手作り
ホウケイ酸ガラスキャピラリー	WPIの	1B100F-4	吸引および接着剤マイクロピペットを作るには
レーザーベースのマイクロピペットプーラー	サッターインストゥルメント	P-2000	吸引および接着剤マイクロピペットを作るには
タイゴンE-3603実験用チューブ	コンポーネントサプライ株式会社	テト-031A	口と吸引のピペット用
P2ピペットチップ	USAサイエンティフィック	〒1111-3700	マウスピペット用
0.6 mL Eppendorfチューブキャップ	フィッシャーサイエンティフィック	05-408-120	解剖のために接着剤を入れるために使用されます
ベトボンド3M	WPIの	ベトボンド	解剖に使用する接着剤
塩化カリウム	フィッシャーサイエンティフィック	P-217	フォーサリン
塩化ナトリウム	ミリポアシグマ	S5886	生理食塩水用
塩化マグネシウム	フィッシャーサイエンティフィック	M35-500	生理食塩水用
塩化カルシウム二水和物	ミリポアシグマ	C7902	生理食塩水用
蔗糖	フィッシャーサイエンティフィック	S5-3	生理食塩水用
HRP:アレクサフロー647	ジャクソン免疫研究	〒123-605-021	神経膜の標識
ヘープス	ミリポアシグマ	H3375-J	生理食塩水用
絵筆	ウィンザー&ニュートン	94376864793	幼虫を操作するには
デュモンデュモスターピンセット #5	WPIの	500233	解剖時に使用
7 cm McPherson-Vannasマイクロハサミ(ブレード3 mm)	WPIの	14177	解剖時に使用
FM1-43	フィッシャーサイエンティフィック	T35356	蛍光スチリル染料
デジタルタイマー	VWRの	62344から641	FM染料のロード/アンロードのタイミングに
LSM 510 META レーザー走査型共焦点顕微鏡	ツァイス		蛍光マーカーのイメージング用
Zen 2009 SP2 バージョン 6.0	ツァイス		共焦点イメージング用ソフトウェア
HeNe 633nmレーザー	ラソス	イメージング中にHRP:647を励起するため
アルゴン488nmレーザー	ラソス		イメージング中にFM色素を励起するため
マイクロフォージ	WPIの	MF200	ポリッシュガラスマイクロピペットの焼成
刺激	草	S48	LEDと電気刺激を制御する
オールトランスレチナール	ミリポアシグマ	R2500	ChR2の必須補因子
カメラポート付きZeiss Stemi Microscope	ツァイス	2000年C月	チャネルロドプシン刺激中に使用
LEDの470nm	トールラボ	M470L2	ChRの活性化に使用
T-Cube LEDドライバー	トールラボ	LEDD1Bの	LEDを制御するには
LED電源	シンコンエレクトロニクス株式会社	TR15RA150	LEDに電力を供給するには
光パワー&エネルギーメーター	トールラボ	PM100Dの	LEDの強度を測定するには
40X Achroplan 水浸対物レンズ	ツァイス	電気刺激および共焦点イメージング中に使用