ラットの視床下核に電極を埋め込む

要約

出典:Fluri, F., et al., Microelectrode Guided Implantation of Electrodes into the Subthalamic Nucleus of Rats for Long-term Deep Brain Stimulation. J. Vis. Exp. (2015)

このビデオは、ラットの視床下核に電極を埋め込んで電気刺激を送達する手順を示しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 麻酔

1. 麻酔システムをチェックして、処置中にガス(酸素)とイソフルランが十分に供給されていることを確認してください。ノーズコーンを脳定位固定装置の切歯棒に接続し、切歯棒を-3.3mmに設定します。
2. 供給ガス(2 L / min)をオンにします。ネズミを箱に入れ、上部を密封します。イソフルラン気化器を3.5%にオンにします。
3. ラットが横臥になったら、切歯バーに固定されているノーズコーンに麻酔ガスが流れるようにシステムを切り替えます。
4. ネズミを箱のチャンバーから取り出し、耳と目の間の領域を剃ります。Jodosept PVPを染み込ませた綿棒を使用して、剃った部分を綿棒で拭き取り、抜け毛を取り除きます。
5. ラットをノーズコーン(図1)に配置し、O₂(1 L / min)中のイソフルラン2.5%で麻酔を続けます。.指間領域をつまんで麻酔のレベルを確認します。ラットが適切に麻酔されれば、防御反射(すなわち、足の引きこもり)は廃止されます。
6. 処置中の呼吸と刺激に対する反応を監視し、必要に応じて気化器を調整します。
7. 麻酔下での乾燥を防ぐために、獣医軟膏を目に塗ります。フィードバック制御の暖房システムは、体温を37°C±0.5°Cに監視および維持します。

2. 手術

1. 手術中、術野を無菌状態に保ちます。外科医の手と手術野が無菌状態になったら、慎重に動き、無菌性を壊さないように注意してください。これには、器具を置くことができる滅菌フィールド(滅菌防水カーテンなど)を持つことが含まれます。
2. 0.2mlのメピバカインを剃った部分の中央に皮下注射します。.メピバカインは、最大3時間の作用持続時間を持つ局所麻酔薬です。さらに手術部位に麻酔をかけます。
3. メスを使用して、耳の間から2cmに向かって正中線を切開します。4つのクランプで頭蓋骨を露出させます(図2)。
4. 綿棒を使用して、冠状縫合糸と矢状縫合糸が露出するまで骨膜を静かに取り除き、その後、脱脂綿で血液を止めます。
5. プローブホルダーに固定された針を使用してブレグマの座標を決定し、次に黒いフェルトペンで針の先端に印を付けます。前/後(AP)、正中線/外側(ML)、背腹側(DV)のドライブスクリューを使用して、針の先端をブレグマの真上に配置します。
6. APとMLのバーニアスケールの測定値を取ります:右側のSTNへの電極埋め込みの場合は、APの読み取り値から3.6 mm、MLの読み取り値から2.5 mmを差し引くか、左側のSTNへの電極埋め込みの場合は2.5 mmを加算します。この位置は、針の先端を頭蓋骨の表面に下げた後のフェルトペンの染料によってマークされます。
7. cl 固定装置の大きなプローブホルダーに歯科用ドリルを固定します。デンタルドリルを計算された領域、つまり頭蓋骨のマークされたポイントに移動します。顕微鏡を覗いて、硬膜が見えるまで頭蓋骨に穴(直径約1mm)を開けます(頭蓋骨の厚さは約1mmです)。マイクロ解剖鉗子または滅菌針を使用して硬膜を引っ込めます。硬膜は電極の先端を破壊するほどの強度があります。
8. 各前頭汽車と電極穴の反対側の頭頂間汐体に歯科用ドリルで穴を開けます。プローブホルダーを脳定位固定装置から外します。静脈血管が頭蓋骨の下の縫合糸に追従するため、頭蓋骨の縫合糸に穴を開けないでください。
9. 5つの穴のそれぞれに骨ネジをねじ込みます。ネジを深くねじ込みすぎないようにしてください。ステンレス製ネジ(M1.6)の場合、ネジを2〜3回転させると、脳に圧力をかけずにネジを適切に保持できます。巻数はネジのピッチによって異なります。clamp プローブホルダーを電極でマイクロマニピュレーター(図3)に
取り付けます。
10. AP、ML、およびDVの駆動ネジを使用して、先端がブレグマにほぼ接触するまで、プローブホルダーを電極と一緒に動かします。ブレグマでのAP、ML、およびDVバーニアスケールの読み取り値に注意してください。測定値が得られたら、電極を数ミリメートル持ち上げて、移動中に電極が頭蓋骨をこすらないようにします。電極を穴に挿入する必要がある位置の座標を決定するには、APの読み取り値に3.6mmを加算し、MLの読み取り値に2.5mmを加算(または減算)します。
11. APおよびMLドライブスクリューを使用して、電極を計算された位置に移動します。この時点で、電極の先端はドリルで開けられた電極穴の真上に配置する必要があります。次に、顕微鏡を覗いて、電極を硬膜のレベルまで下げます(図4)。このレベルは、DV 方向のゼロ レベルとして機能します。その後、顕微鏡を覗いて電極の先端を脳にそっと挿入します。
12. 電極ピンを録音システムコネクタに接続します。ファラデーケージを定位固定装置のラットの上に置きます(またはアルミホイルで置き換えます)(図5)。定位固定装置を作業中の部屋のカウンターポイズで接地します。
13. 録音システムを起動します。可能な場合は、スピーカーを使用して、電極を進めながら単一ユニットの放電/軟膏の音響信号を取得します。
14. 電極を進めながら電気活動を記録することにより、電極を脳にゆっくりと挿入します。硬膜から7.5〜8.1mmの深さでは、通常、STNの特定の電気的活動を検出できます(図6)。STNのニューロンの典型的な活動は、不規則な発火パターンと高い発火率(平均周波数:40.9 ± 12.9 Hz)を特徴としています。
15. 記録中は、麻酔をできるだけ減らします(例えば、0.8〜1.0%);低麻酔動物は、より明確な電気的脳活動を示します。
16. 電極を下げたときに頭蓋骨の表面から変位した血液や脳脊髄液を綿棒で拭き取ります。
17. 少量の歯科用セメントを混ぜ合わせ、小さなヘラを使用して電極の周りと5本のネジのうち4本の周りに塗布します(図7)。5本目のネジは、プラグのアース線を固定するために使用されます。
18. 電極ピンを電極ホルダーから外し、歯科用セメントが固定されたら記録システムを接続します。
19. 歯科用セメントで固定されていないネジを緩めます。プラグを電極ピンに取り付けます。プラグのアース線を5本目のネジ(図8)で固定します。
20. デンタルセメントを混ぜ合わせて、プラグの周りに塗布します。セメントが濃くなったら、プラグの周りに成形してキャップを形成します。動物に害を及ぼす可能性のある歯科用セメントの鋭いエッジを避け、硬化中にそれらを取り除きます(図9AおよびB)。
21. 傷口の端を創面切除し、キャップの前面と後ろで縫合糸で閉じます。その後、傷口の縁を消毒します。
22. ヘッドプラグをスイベルに固定されているワイヤーに接続します。ラットを脳定位固定装置から取り外します。
23. 介入の最後にトラマドール(12.5 mg / kg、腹腔内)を適用し、その後1日1回2〜3日間適用します。.ラットをサーマルサポート付きの清潔なケージに置き、このケージにスイベルを固定し(図10)、1時間注意深く点検します。
24. 動物が胸骨の横臥を維持するのに十分な意識を取り戻すまで、動物を放置しないでください。

結果

図 1.脳定位固定装置への頭部の固定。ラットは、定位固定装置フレームのイヤーバーとガス麻酔マスクによって固定されています。

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図 2.頭蓋骨を露出させます。正中線切開後、皮膚と骨膜を創傷端まで転がし、4つのクランプを使用して手術領域から遠ざけます。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Pt/Ir電極	FHC株式会社	UE	カスタムメイド:仕様:UEPSEGSECN1M
プラグ	GT Labortechnik(ドイツ/アルンシュタイン)
ピンヘッダー	ディストレレック	143〜95〜324	1列、90°1x3データメイト、M80-8420342
ソケット	ディストレレック	143*95-621	単列ストレート2mm極 No.1x3 データメイト M80-8400342
ステンレス製スプリング	プラスチックONE	SS0102	パーツ#:.120 X .156スプリングID(mm):3.0スプリング外径(mm):4.0
歯科用セメント/パラドゥール	ヘレウス・クルツァー	64707938	リキッド、500 ml
歯科用セメント/パラドゥール	ヘレウス・クルツァー	64707954	パウダー、ローズ、500g
ヘッドスクリュー	ハマー&リース	V2ADIN84 M1.6x3
ジョドセプトPVP	ベトキノール		435678/E04
メピバカイン 1%	アストラゼネカ		PZN03338515
エピネフリン	サノフィ-アベンティス		PZN00176118
トラマドール塩酸塩	ロテックスメディカ		38449.00.00

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