ラットの横隔神経を刺激することで複合筋活動電位を測定

要約

出典:Martin, M. et al.横隔膜運動ニューロンによる横隔膜神経支配の機能的および形態学的評価。J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオでは、横隔神経刺激を通じてラットの横隔膜筋線維に複合筋活動電位(CMAP)を記録する方法を説明しています。横隔神経に高強度の電気パルス刺激を与えると、横隔膜筋線維に活動電位が生じ、応答曲線を得ることで活動電位が観察されます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 動物の準備:

1. 1〜2%の吸入剤(イソフルラン)を使用してラットに麻酔をかけ、効果を発揮するか、注射(ケタミン、キシラジン、アセプロマジン)で投与します。注射麻酔の投与量は次のとおりです:ケタミン95.0 mg / kg、キシラジン10.0 mg / kg、アセプロマジン0.075 mg / kg.
   手記：このCMAP記録プロトコルを実施する際には、吸入麻酔と注射可能な麻酔薬の両方のアプローチをうまく使用しています。
2. 動物は、手術が開始される前、手術の終了まで、および術後のブプレノルフィンが効果を発揮するまで、適切な麻酔薬の深さに維持する必要があります。.つま先を短くつまんで適切な麻酔を確認し、離脱反応が引き起こされていないことを確認します。.さらに、綿棒で角膜反射をテストします。外科的処置全体を通して、心拍数と呼吸数が増加していないこと、つまり麻酔薬の深さが軽くなりすぎたことを示唆していることを確認します。
3. 麻酔下の乾燥を防ぐために、動物の目に獣医軟膏を塗ります。
4. 外科医は、手術を開始する前に消毒剤(クロルヘキシジンスクラブ)で手を洗う必要があります。外科医は、滅菌手袋、フェイスマスク、ガウンまたは清潔な白衣を着用する必要があります。すべての器具は、手術前に洗浄し、オートクレーブする必要があります。インスツルメントのレベルでオートクレーブする前に、インスツルメントキット内に滅菌インジケーターストリップを追加して、滅菌が完了したことを確認します。外科医は、手術を開始する前に、ストリップのライン全体が黒であることを確認する必要があります。箱の外側にもオートクレーブテープを貼ってテープで留めます。同じ日に複数の動物に手術を行う場合は、手術の合間に器具を清掃し、ガラスビーズ滅菌器で滅菌してください。必要に応じて、器具のハンドルを滅菌器に適切な時間置き、滅菌止血器で器具を取り外し、滅菌フィールドで冷却してから、器具の機能端をガラスビーズ滅菌器に適切な時間配置することにより、ガラスビーズ滅菌器で器具の両端を滅菌します。
5. 動物に麻酔をかけたら、背側を下にして腹部を上にして手術用ボードに置き、テープを使用して動物の前肢を手術用ボードに固定できるようにします。
頭蓋骨
6. の基部から腹面を尾側に剃り、記録されている半横隔膜に応じて、正中線の両側の腹部の周りの領域が剃られることを確認します。ポビドンヨードを剃った肌の表面に塗ります。

2. CMAP録音の準備:

1. 動物の準備後、接地電極を尾部に皮下に配置します(図1)。
2. 参照電極を対側下腹部に皮下に配置します。.
3. 自己接着性表面ストリップまたはディスク記録電極(表面ストリップ電極寸法:0.5×3cm)に導電性ゲルを載せ、次いで表面電極を片側肋骨縁に沿って横方向に配置する。
4. 刺激電極を経皮的に気管の外側に0.5cm離し、鎖骨の上に配置します。電極を皮膚から約1.0cmの深さで挿入します。電極を手で固定して、その後の刺激で電極の位置が動かないようにします.
   手記：挿入部位の皮膚に対して90°の角度刺激電極。

>3. Compound Muscle Action Potential(CMAP)の記録:

1. 刺激装置/増幅器を使用して電気生理学的記録を取得し、その後にコンピューター支援データ分析を行います。
2. シングルプル刺激の刺激パラメータは、0.5ミリ秒、1.0Hzの最大パルスである必要があります。刺激の振幅は6.0〜8.0Vである必要があります(図2A).
   手記：実験内では、動物間で同じ振幅の刺激強度を使用します。目的は、刺激の最小振幅を使用して応答振幅を最大化することです。刺激時に発生する最初の応答は、刺激アーティファクトであることに注意することが重要です。さらに、刺激アーチファクトの後に安定した/平坦なベースラインが先行するCMAP応答が得られるように注意する必要があります。その後、迅速なCMAP応答が続きます。このような応答を得るためには、刺激電極および/または記録電極を再配置することが必要な場合がある。
3. 刺激と刺激の間に30秒待ち、10回の刺激を連続して繰り返して、平均応答を求めます(図2B-C)。ベースラインからピークまでの振幅を測定します(図2A)。横隔神経/横隔膜が活性化されていない動物の呼吸周期の段階で横隔神経刺激を行います。この手順は、対側の半横隔膜について同じ動物で繰り返すことができます。
4. 最終的なCMAP記録セッションの後、横隔膜神経筋接合部(NMJ)染色が行われる場合は、動物を灌流します。CMAP記録は、同じ動物に対して約1週間に1回(または選択した間隔で)繰り返し実施します。
5. サバイバルCMAP記録に続いて、動物は循環温水加熱パッドで回復し、回復中に目が覚めて厳格に横臥するまで継続的に監視します。手術を受けた動物は、完全に回復するまで他の動物と一緒に戻さないでください。
6. 船尾に横たわったら、最初の48時間は12時間ごとに動物を監視します(その後は1日1回)。動物が脱水状態(皮膚のたるみ、倦怠感)が見られる場合は、術後の体重と体液の損失が安定するまで、液体(乳酸リンガー溶液;皮下;注射ごとに1〜2 ml、部位を回転させて;1日2回)を投与します。.術後の急性期には、必要に応じて小さな皿に柔らかくした餌を与え、ワイヤーバーの蓋フィーダーに手が届かない場合は食事を促します。
7. ブプレノルフィンを手術終了前に0.05 mg / kgの用量で投与し、その後最初の24時間は12時間間隔で(その後の痛み/ストレスの兆候によって異なります)皮下注射(部位が回転)を介して投与します。.その後、痛みや苦痛の兆候が見られた場合は、動物をブプレノルフィンで治療します。.痛み/苦痛を示す兆候には、活動の欠如、発声、飲食の欠如(脱水症)、過度の体重減少、ガード、過度のかじり、切開部位の引っ掻き傷などがあります。痛みや苦痛を判断するために使用される追加の基準には、外部刺激に対する無反応、一時的または挑発的な発声、苦痛または異常な呼吸、持続的な赤褐色の鼻眼分泌物、顕著な立毛が含まれます。また、病気の動物を示唆するような衛生状態の悪さの証拠も監視してください。72時間の治療後も動物が苦痛を感じていることが観察された場合(上記の痛み/ストレス基準に従って、上記の鎮痛プロトコルを受けた後)、動物を安楽死させます。

結果

図1:CMAP電極の配置。接地電極は尾部に皮下に配置されます。参照電極は腹部に配置されます。表面記録電極は、片側肋骨縁に沿って横方向に配置されます。刺激性電極は赤と黒の両方で描かれています。

図2:CMAPの記録と分析 (A) CMAP応答の振幅は、ベースラインからピークまで測定できます。典型的なCMAP応答は、刺激アーチファクトと応答曲線の両方を示す必要があります。(B-C)代表的な平均 CMA...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
小さな春ばさみ	ファインサイエンスツール	15002-08
解剖鉗子	ファインサイエンスツール	11295から51
CMAP録音用ソフトウェア	スコープ3.5.6;アディ
ディスク表面電極	ナタス神経学	019-409000
皮下針電極	ナタス神経学	019-453100
導電性ゲル	アクアソニック	〒122-73720
CMAP録音用スティミュレーター/レコーディングシステム	アナログ・デバイセズのPowerlab 8SP刺激装置
CMAP録音用アンプ	バイオAMP