インビボDrosophila melanogasterにおけるシナプス局在カルシウムセンサを用いたカルシウムイメージング

要約

出典:Hancock, C. E. et al., Drosophila melanogasterにおける学習誘発シナプス可塑性のIn Vivo光学カルシウムイメージング.J. Vis. Exp. (2019).

このビデオは、ハエのシナプス局在カルシウムセンサーを使用したin vivoカルシウムイメージングの方法を示しています。顕微鏡検査用のハエの準備、嗅覚コンディショニングの実施、および臭気によるカルシウム流入の視覚化の手順を概説しています。

プロトコル

1. トランスジェニックショウジョウバエ、Drosophila melanogaster

1. 雌の処女バエと雄のハエを交配し(12時間の明暗サイクルで相対湿度60%の25°Cで飼育)、それぞれ目的のGal4およびUASコンストラクトを運び、目的の特定のニューロンが遺伝的にコードされたカルシウム指標を発現するハエを産生します。
2. 上記の交配の雌の子孫を、卵閉後3〜6日の範囲に入るまで老化させます。メスのハエは、サイズが少し大きいため、好ましいです。

2. カルシウムin vivoイメージングのためのショウジョウバエの作製

1. 1匹のメスのハエを選択し、氷上で5分以内に麻酔をかけます。
2. 細い鉗子を使用して、フライをイメージングチャンバーに入れます(図1cに示されています)。胸部と脚がチャンバーの下部にある電線に接触していること、およびヘッドが平らになっていることを確認します。フライの位置を透明な粘着テープで固定します.
   手記：このプロトコルには、ハエが固定され、ヘッドカプセルが開くことができるようにし、ハエがアンテナへの臭気刺激と胸部と脚への電気ショックの両方を受け入れることができる特注のチャンバーが必要です(図1)。
3. メスの柄に固定された外科用メスの刃(材料の表を参照)を使用して、ハエの頭の周りのテープの窓を切り取り、アンテナを覆い、胸部の最前部のみを露出させます。
4. 頭の側面と後頭部を青色光硬化接着剤で囲み、凹凸の顎で保持された昆虫ピンを使用して慎重に操作します。青色の発光LEDランプを使用して接着剤をセットします。
5. 接着剤が完全に固まっていることを確認し、フライヘッドの背側表面に残っている未硬化の接着剤を取り除きます。
6. リンガー液(材料の表を参照)を一滴垂らして、頭の露出したキューティクルを覆います。
7. 非常に刃の細いスタブナイフを使用して、キューティクルを切り抜きます。キューティクルを最も効率的に除去するには、まずオセリを出発点として頭の後部を横切って切ります。次に、目の内側の両側を切り取り、鉗子を使用して簡単に引き裂くことができるキューティクルのフラップを形成します。
8. 関心のある脳領域をブロックする可能性のある余分なキューティクルをすべて取り除きます。
9. 細かい鉗子を使用して気管の背側表面を慎重に取り除き、脳組織自体の破壊を避けます。必要に応じてリンガー溶液を取り外してリフレッシュします(材料の表を参照)組織破片の領域を取り除きます。.
10. 皮下臭気送達針をフライの頭から約1cmの位置に置きます。.アンテナへの臭いの伝達を妨げる可能性のあるものがないことを確認してください。
11. 顕微鏡で、皮下臭気送達針を介してイメージングチャンバーを臭気送達システムに接続します。
12. ハエが麻酔と手術から完全に回復し、空気の流れに適応できるようにするために、この段階で10分間の休息期間を実装します。

3. 生体内カルシウムイメージング

1. 赤外線レーザーと水浸対物レンズ(材料の表を参照)を備えた多光子顕微鏡を振動遮断テーブルに設置して使用します。緑色蛍光タンパク質(GFP)ベースのカルシウムインジケーターを可視化するには、レーザーを励起波長920 nmに調整し、GFPバンドパスフィルターを取り付けます。
2. 粗いZ調整ノブを使用して、脳のZ軸をスキャンし、関心のある脳の領域を特定します。クロップ機能を使用して、この領域のみにスキャンを集中させ、スキャン時間を最小限に抑え、頭の前方が下を向くようにスキャンビューを回転させます。
3. フレームサイズを512 x 512ピクセルに、スキャン速度を>4Hzに調整し、スキャン領域(Y次元)を調整して、目的のニューロンがカバーされるようにします。

>4. 嗅覚コンディショニングによる臭気誘発カルシウム過渡現象の可視化

1. 複数の臭気刺激を時間的に正確に送達できる臭気送達システムを使用します。
   1. 追加のコンピューターを使用してデバイスを制御し、イメージング顕微鏡ソフトウェアと通信して、実験中の画像キャプチャと臭気刺激を調整します。
   2. 画像取得ソフトウェアと臭気送達プログラム(例:顕微鏡制御ソフトウェアにインストールされたVBAマクロパッケージ、材料の表を参照)をリンクできる事前にプログラムされたマクロパッケージを開始します。これは、別のプログラムでの臭気送達プロトコルの開始によって提供される外部入力トリガーに応答します)。
2. 512 x 512 px の解像度と 4 Hz のフレーム レートで、"事前学習"/ナイーブな臭気誘発カルシウム過渡現象を監視して測定を開始します。臭気発生の 6.25 秒前 (F₀ ベースライン値を確立) と臭気オフセットの 12.5 秒後に追加の画像取得を挟んだ 2.5 秒の臭気刺激を提供します。これを2番目の臭気物質で繰り返し、次に3番目の臭気物質で繰り返します。
3. この測定の3分後、フライを古典的条件付け(「トレーニング」)して続けます。
   1. 「プレトレーニング」フェーズで提示された臭気の1つを選択して条件刺激(CS⁺)の臭気にし、もう1つを選択してCS^-臭気にします。コンピュータ制御の臭気配信システムを使用して、CS⁺の臭気を60秒間、12回の90V電気ショックとともに提示します。
   2. 60秒の休憩後、CS^-臭気を単独で60秒間提示し、4-メチルシクロヘキサノールと3-オクタノールを臭気物質として使用します。このトレーニング中に3番目の臭気物質(例:.、1-octen-3-ol)は、トレーニングフェーズの前（ステップ4.2)とトレーニングフェーズ）後（ステップ4.4）のみ制御として使用されます。
4. トレーニングフェーズ(ステップ4.3)の終了から3分後に「トレーニング前」の臭気刺激プロトコル(ステップ4.2)を繰り返すことにより、「トレーニング後」の臭気誘発カルシウム過渡現象を再度測定します。
   手記：このステップのタイミングは、記憶形成後の関心のある時間を反映する必要があります(たとえば、このステップを条件付けステップの3〜4分後に実行して、短期記憶を調査します)。通常、ハエはこの準備で数時間生き残ることができます。
5. イメージングファイルは、後で画像解析を行うために、適切な形式(Tiffなど)で保存します。

5. 画像解析

1. 画像を分析するには、フィジーなどの画像分析ソフトウェアでTiff(または同様の)ファイルを開きます。
2. 移動補正アルゴリズムを使用してスタックを位置合わせし、X 方向と Y 方向への移動が最小限に抑えられるようにします。Z軸に強い動きが見られる録音は破棄します。
3. 調査する領域の周囲の関心領域 (ROI) をマークするために使用されるソフトウェアツールを選択します。これは、バックグラウンド蛍光の影響を制限するために、可能な限り正確である必要があります。
4. それぞれのソフトウェアツールを使用して、選択したROIから時間的蛍光強度データをデータファイルとして抽出し、記録の各フレームに対して値が生成されます。
5. データ解析プログラムを使用してデータを開き、各臭気トレースのΔF/F₀値を計算します。F₀ = 臭気発生の 2 秒前の平均蛍光。ΔF = 特定のフレームの生の蛍光とF₀の差。これらの値から、各フレームのΔF/F₀値を計算し、時間に対してプロットして、臭気刺激期間全体の相対的な蛍光を反映することができます。

結果

図1:イメージング用のハエの取り付けチャンバーの構築と準備。(a)フライ取り付けチャンバーの構築手順。ベースは、細かいプラスチックメッシュ(2)で覆われた標準的な顕微鏡スライド(1)で形成されています。対向する電荷(3)を運ぶ2本の電線が両側のスライドに接着されています。ワイヤーは剥がされ、互いに平行に走るスライド(4)を横切るように曲げられますが、接触することはありません。透明な粘着テープ(5)の層を、ハエの高さ(約1 mm)に達するまで追加します。チャネルは、ハエの幅に合うように、幅約1mmのテープを垂直に切り取ります(6)。透明な粘着テープ(7)で作られた高架プラットフォームは、胸部がワイヤーの上にある間、ハエの頭の枕を形成するために電線のすぐ上に構築されています。(b)2光子顕微鏡下に配置されたハエの概略図。臭気刺激は、...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
1-オクテン-3-オール	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス)	O5284	匂い物質として使用される化学物質
3-オクタノール	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス)	218405	匂い物質として使用される化学物質
4-メチルシクロヘキサノール	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス)	153095	匂い物質として使用される化学物質
EGFP用バンドパスフィルター(525/50nm)	Carl Zeiss Microscopy GmbH、イエナ、ドイツ
透明粘着テープ	Tesa SE、ノルダーシュテット、ドイツ		標準透明粘着テープ
凹凸顎	ファインサイエンスツール、ノースバンクーバー、カナダ	10053-09	凹凸ジョー付きブレードホルダー
細い鉗子	ファインサイエンスツール、ノースバンクーバー、カナダ	11412から11	先端付き鉗子 0.1×0.06mm
皮下注射針	Sterican - B. Braun, メルスンゲンク, ドイツ	4665120	1.20×40ミリメートル
昆虫のminutienピン	ファインサイエンスツール、ノースバンクーバー、カナダ	26002-10	直径0.1mm、先端0.0125mm
ケントフロー	Kent Express Dental Supplies、ジリンガム、英国	953683	ブルーライト硬化接着剤
顕微鏡スライド	Carl Roth GmbH & Co. KG, カールスルーエ, ドイツ	656.1	標準対物レンズスライド 76 x 26 mm
鉱油	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス)	M8410	臭気物質の希釈剤として使用
モードロックTi-Sapphireレーザーカメレオンビジョン2	Coherent Inc., Santa Clara, CA, USA (米国カリフォルニア州サンタクララ		チューナブル赤外線フェムト秒レーザー
BiG検出器を搭載した多光子顕微鏡LSM 7MP	Carl Zeiss Microscopy GmbH、イエナ、ドイツ		多光子顕微鏡、複数の企業が同様のデバイスを提供しています。
Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) 水浸対物レンズ	Carl Zeiss Microscopy GmbH、イエナ、ドイツ	421452-9900-000	対物レンズ W "プランアポクロマート" 20x/1.0 DIC M27 70mm
Ringerのソリューション	N.A.	N.A.	5mM KCl、130mM NaCl、2mM MgCl2、2mM CaCl2、5mM Hepes-NaOH、36mMスクロース、pH = 7.4
スタブナイフ	Sharpoint, Surgical Specialties Corporation, レディング, ペンシルベニア州, USA	72-1551	5.0mmストレート制限刃深さ
外科用メス用刃	スワン・モートン、シェフィールド、イギリス	303	品番:11
外科用メス用ハンドル	スワン・モートン、シェフィールド、イギリス	907	品番:7S/S
Visual Basics of Applicatons(VBA)は、臭気伝達装置からトリガーを受け取り、電気ショックアプリケーション装置(電源)は、顕微鏡を制御するZeissのZENソフトウェアと対話します。	カスタムメイドで、ご要望に応じてご利用いただけます	N.A.	N.A.

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