微小電極アレイシステムを用いた超音波誘導神経調節

要約

出典:Liang, R. et al., Focused Ultrasound Neuromodulation of Human In Vitro Neural Cultures in Multi-Well Microelectrode Arrays. J. Vis. Exp. (2024)

このビデオは、集束超音波トランスデューサーを使用して、マルチウェル微小電極アレイまたはMEAシステムで培養ヒトiPS細胞由来ニューロンの神経活動の調節を誘導する方法を示しています。

プロトコル

1. 材料の準備

1. 培地を吸引し、それを使用して、微小電極アレイ(MEA)が埋め込まれた24ウェルニューロン培養プレートの1つのウェルを充填します(図1A)。
2. パラフィルム界面、輪ゴム、集束超音波(FUS)コーンをゴム膜で70%エタノールを使用して10分間滅菌し、後で組み立てるためにヒュームフードに入れます。
3. 脱気 300 mL の脱イオン水と 50 mL のカップリング ゲル。カップリング媒体内でキャビテーションが誘発されないように、水とゲルを160 x gで5分間遠心分離します><。 手記：ヒト人工多能性幹細胞(HiPSC)の元の供給源は、GM01582細胞株とCIPS細胞株です。平均して、ウェルあたり5 x 10⁴運動ニューロンと2.5 x 10⁴アストロサイトの密度を達成できます。

2. 周辺機器の接続とセットアップ

1. FUSコーンをネジでトランスデューサに固定し、換気された滅菌フード内の柔軟なゴム膜でコーンを密封します。ステップ1.3の脱気および脱イオン(DG-DI)水でコーンを満たし、キャビテーションを避けるためにコーンに気泡がないことを確認します。
2. カスタマイズされたネジ付きロッドを使用して、3Dプリントされたホルダーをフレームに固定します(図1B)。FUSトランスデューサーのヘッドが刺激されるウェルの上にくるようにフレームを配置します。
3. ラバーバンドを使用して、培地とHiPSCを含む24ウェルMEAプレート上のウェル上にパラフィルムを固定します。
4. 超音波トランスデューサのバックエンドドライバエレクトロニクス(この場合はトランスデューサー電力出力(TPO))を100〜240 Vの電源コンセントに接続し、マッチングネットワークをTPOとFUSトランスデューサに接続して、FUSシステムを準備します。マッチングネットワークにより、トランスデューサとTPO間の効率的な電気的結合が保証されます。
5. MEAシステムを電源コンセント(100〜240 V)に接続します(図2B、接続5)。MEAシステム同期ポートをTPOに接続します(図2B、接続3)。この接続により、MEAシステムによるデータ取得がFUS刺激と同期されます。
6. 24ウェルMEAプレートをMEAシステムに置き、蓋を取り外して、トランスデューサーとウェルが直接接触できるようにします。ステップ3.2(図2Aおよび図1B)で説明されているように、脱気したカップリングゲル用のスペースを確保するために、トランスデューサーをウェルプレートの5〜10mm上に配置します。

3. 刺激と神経信号の獲得

1. TPOコントロールパネルでFUSパラメータを設定します(表1)。
2. パラフィルムの上にカップリングゲルを塗布し、FUSトランスデューサーをカップリングゲルに下げて、気泡を最小限に抑えてゲルとの接触を確保します(図1A)。
3. ユーザーインターフェースの[開始]ボタンをクリックして、MEAシステムの録音を開始します。
4. TPOの右下のボタン(図2A、ラベル7)を押してFUSソニケーションを開始し、ニューロンがベースライン状態に戻るまで、ソニケーションの各ラウンドの間に少なくとも5分待ちます。
5. FUSシステムによって生成されたトリガーパルスを使用して、FUS刺激シーケンスをMEA記録に合わせます(図1B、接続3)。

>表1:TPOに設定された集束超音波(FUS)パラメータ

の ミリメートル

パラメーター	価値
最大出力/チャンネル	1.200 W
事実関係	0.749 W /チャネル
ISPPAの	10.79 W / cm2
ISPTAの	0.05 W / cm2
バースト長	0.100ミリ秒
周波数	250.00 kHz
焦点	39.800
時代	20.000ミリ秒
タイマー	60.000秒

結果

図1:マルチウェル微小電極アレイ(MEA)によるFUS神経調節。(A)マルチウェルMEAによるFUSニューロモデュレーションのセットアップの概略図。FUSトランスデューサによって生成された音波は、脱気水で満たされたFUSコーンを伝搬し、超音波ゲルを使用して結合されます。パラフィルムは、汚染を防ぐためにゴムバンドを使用してウェルに固定されます。MEAプレートは、ニューロンからの電気記録をMEAシステムに送信します。(B)MEAシステムに含まれるマルチウェルプレート上のFUSトランスデューサーの写真。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
MEAシステム	アクシオンバイオシステム株式会社	マエストロエッジ	サンプリングレート:11500 Hz
MEAプレート	アクシオンバイオシステム株式会社	CytoView MEAの	電極とウェル:24ウェルに16個の電極
ウェルプレートインターフェース	株式会社Amcor	パラフィルムPM996;P7793	厚さ:127μm
培養用CO2タンクとレギュレータ	エアガス株式会社/ハリス株式会社	9296NC	濃度:5%
カルチャーメディア	サーモフィッシャー株式会社	ラミニン; 23017-015	濃度:1 μg/mL
HiPSCニューロン	ペプロテック	CIPS と GM01582 派生; 450-10	濃度:10 ng/mL (Taga et al [2021]13 参照)
トランスデューサー	株式会社ソニックコンセプト	CTX250;008	中心周波数:250kHz
マッチングネットワーク	株式会社ソニックコンセプト	CTX250;NFS102v2	インピーダンス:50 Ω
トランスデューサー出力(TPO)	株式会社ソニックコンセプト	バージョン 4.1; 020	周波数:250kHz〜2.5MHz
膜	株式会社マクマスター	シリコーンゴム; 5542N115	厚さ: 0.0127 cm
カップリングゲル	株式会社パーカー研究所	アクアソニック100;B08DDWG GXBの	粘度:130,000〜185,000cop
プローブホルダーへの接続	株式会社マクマスター	スティールスレッドロッド; 90322A661	長さ:長さ1〜1/2インチ
ハイドロフォン	株式会社ソニックコンセプト	Y-104; 009	範囲:50 kHz〜1.9 MHz
水槽	株式会社ソニックコンセプト	重量	サイズ:30cm×30cm×30cm
ウォーターコンディショニングユニット	株式会社ソニックコンセプト	WCUの;SN006	流速:最大50 mL/s
オシロスコープ	ローデ・シュワルツ(株)	RTC1002	サンプリングレート:最大50MHz
舞台	株式会社ソニックコンセプト	マイクロステージ; 2	精度:1μm
サーモクロミックシート	株式会社TIPTEMP	液晶シート;TLCSEN337	範囲:22〜24°C
コンピュータ	Microsoft Surface	Surface Pro	CPU i5 1035G4:3.7 GHz
データ転送ソフトウェア	Mathworks株式会社	MATLAB	バージョン2021b
プロセッシングソフトウェア	Pythonソフトウェア基盤	ニシキヘビ	バージョン 3.7.10