光依存性イオンチャネルを持つ細胞の光遺伝学的電気生理学記録

1. 録音前の設定

1. 表1に示すように、イオン濃度で記録溶液を調製します。​
   1. 超純水中の2 Mストック溶液15 mLを調製し、MgCl₂、CaCl₂、KCl、およびCsClについて調製します。
   2. 表1に従って、細胞内緩衝液100 mLと細胞外緩衝液500 mLの固体成分を別々のビーカーに秤量し、その後、調製したストック溶液をそれぞれの量に加えます。例えば、細胞内バッファーには、0.3803 g(10 mM)EGTA(エチレングリコール四酢酸)、0.2383 g(10 mM)HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)および0.6428 g(110 mM)NaClを使用し、2 M MgCl₂およびCaCl₂を100 μL、2 M KClおよびCsClストック溶液を50 μL添加します。
   3. 超純水を加え、測定を妨げない、つまりクエン酸やN-メチル-D-グルカミン(NMG+)などのChR(チャネルロドプシン)によって伝導されない酸と塩基を使用してpHを慎重に調整します。
   4. 浸透圧を細胞内溶液で 290 mOsm に調整し、glucose.
      を含む細胞外溶液で浸透圧を 320 mOsm に調整します。 手記：わずかに低浸透圧の細胞内溶液は、パッチングの成功率を高めます。
   5. 滅菌 0.22μmフィルターを通してすべての溶液をろ過します。溶液は4°Cで2週間保存するか、-20°Cで凍結して長期保存してください。
2. 液路電位を計算し、記録プロトコルを準備します.
   注:全細胞構成を確立した後の細胞外塩化物濃度の変化は、修正が必要な大きな液体接合電位(LJP)を引き起こします。LJPは直接測定または計算できますが、ここでは後者のオプションが使用されます。このプロトコルでは、オンライン補正が使用され、外部バッファごとに1つの記録プロトコルが要求されます。ただし、より大きな外部ソリューションのセットでは、誤った修正を避けるために LJP の事後修正をお勧めします。
   1. ジャンクションポテンシャル計算機 (JPC) を開き、[新しい実験] ダイアログを開きます。次に、「パッチクランプ測定」を選択します。「全細胞測定」と「標準塩溶液電極」を選択し、25°Cの温度を入力します。各ステップの間に、「次へ」ボタンを押して選択を受け入れて先に進みます。
      注:実験は、空調の効いた実験室で25°Cの室温で行われます。実験を開始する前に、緩衝液が室温であることを確認してください。サンプル温度を変化させるために、インキュベーションステージまたはチャンバーを使用することができます。お風呂の温度は、温度計で頻繁に測定できます。
   2. ピペットで分注した溶液と高塩化物緩衝液の個々の陰イオン濃度と陽イオン濃度をすべて、表 1.
      に示す濃度に従って加えます。 手記： JPC は、開始条件の LJP を -0.5 mV と計算します。
   3. 「New Bath Solution」をクリックして、低塩化物緩衝液の陰イオン性およびカチオン性組成を入力します
      手記：JPCは、変更された細胞外記録ソリューションに従って、+12.6mVの新しいLJPを計算します。
   4. 2つの測定条件に対して、適用された保持電位から計算されたLJPを差し引いて、LJP補正プロトコルを2つ準備します。高濃度の場合は-0.5 mV、低塩化物外部溶液の場合は+12.6 mVです。したがって、プロトコルはそれぞれ-79.5 mV(高塩化物)と-92.6 mV(低塩化物)で開始し、どちらの場合も-80 mVのLJP補正開始保持電位を取得します
      手記：次の手順は、材料リストに記載されているデータ収集ソフトウェアに適用されます。
   5. アクイジションソフトウェアでプロトコルエディターを開きます。「Mode」メニューから「Episodic stimulation」を選択し、7つのスイープを含めます。
   6. エディタの[Waveform]メニューに切り替えて、保持電位が0 mVの200 msの周期と、高塩化物の保持電位が-79.5 mVから始まるさまざまな保持電位の2 s周期を含めます。2 番目のピリオドに 20 mV の「デルタ レベル」を含めて、各スイープで保持電位を 20 mV 増加させます。
   7. 波形エディタの電圧ステップ内で、540nmの光(3.10mW/mm²)で500msの照明を印加します。これを行うには、光源を制御する接続されたシャッターの「デジタルビットパターン」を、上記の2番目の周期(1.2.6を参照)から500ミリ秒後にアクティブに変更します。
      手記： 光強度は、振幅や不活性化などのチャネル電流の生物物理学的特性に影響を与える可能性があります。したがって、光の電力密度は常に報告する必要があります。すべての光学系とカバーガラスを通過した後の光力を測定するには、校正済みのオプトメーターを使用します。電力密度を計算するには、物体マイクロメータで対物レンズの照光フィールドを決定し、測定された光パワーを決定された照らされたフィールドで割ります。
   8. 高塩化物細胞外溶液のプロトコールを保存します。プロトコルを変更し、第 1 レベルの保持電位を -92.6 mV (低外部塩化物) に置き換えます。この2番目のプロトコルを保存して、低塩化物の細胞外状態を測定します。
3. 適合したプロトコルによるガラスカバースリップのリジンコーティング。​
   1. ガラスのシャーレに100枚のカバースリップを数枚入れ、HCl(1N)250mLを加えます。
   2. カバースリップを取り付けたペトリ皿をリニアシェーカーに置きます。120rpmで72時間振とうしてカバーガラスを清掃し、その後、超純水ですすいでpHを中和します。
   3. これらを少量の95%エタノールに浸して、さらに洗浄します.
      注:きれいなカバースリップは、続行する前に70%エタノールで保存できます。次の手順では、層流フードの下で作業します。
   4. ブンゼンバーナーとピンセットを使用して、各カバースリップに火をつけ、新しいシャーレに移します。
   5. ガラスカバースリップを滅菌済みの50 μg/mLポリD-リジン溶液と室温で少なくとも1時間(または一晩)インキュベートし、150 rpmのリニアシェーカーで振とうします。
   6. カバーガラスを超純水で洗い、余分なポリ-D-リジンを取り除きます。
   7. 滅菌紙にカバースリップを広げて10分間乾燥させ、UV(紫外線)光を当てて滅菌します(少なくとも20分)。
   8. カバースリップは、使用するまでアルミホイルで覆われた滅菌ペトリ皿に集めます。
4. 標準的な分子生物学的手法を用いて、mCherryに融合したPsACR1遺伝子のDNAを調製します。​
   1. 制限酵素またはその他の確立されたクローニング方法を使用して、PsACR1をコードするヒトコドン最適化遺伝子配列をpeGFP-C1プラスミド(CMV(Cytomegalovirus)プロモーター、カナマイシン耐性)にmCherryフルオロフォアでフレーム内でクローニングします
      注:他の蛍光色素も使用できますが、顕微鏡で蛍光を観察するための対応するフィルターセットを用意してください。
   2. プラスミドDNAを標準プロトコルに従って熱ショックによりケモコンテントXL1Blue大腸菌細胞に形質転換し、寒天プレート(30 μg/mLカナマイシン)にプレートします。メッキされたバクテリアを37°Cで一晩増殖させます。
   3. 翌日、30 μg/mLのカナマイシンを添加した4 mLのリゾジェニーブロス培地に単一コロニーの細胞を接種し、インキュベーターで37°Cおよび180 rpmで一晩インキュベートします。
   4. 一晩インキュベートした後、メーカーの指示に従って、市販のキットを使用して培養物からプラスミドDNAを精製します。
5. 細胞を播種します
   注意: 層流フードの下で手順を実行します。
   1. リジンコーティングされたガラスカバースリップを最大3枚まで並べて35mmのシャーレに入れます><。 手記： 互いに滑り落ちないように、皿の底にそっと押し付けます。
   2. 1.5 x 10⁵ HEK(ヒト胚性腎臓細胞)細胞を2 mLの標準ダルベッコ修正イーグル培地(DMEM)に播種し、各皿に10%のウシ胎児血清(FBS)を添加します。
   3. 全トランスレチナールを最終濃度1μMで補充し、ステップ1.6に進む前に少なくとも1日間細胞を増殖させます。
6. リポフェクションを介して細胞を一過性にトランスフェクションします。
   1. 細胞の各ディッシュについて、FBSを含まない250 μL DMEMおよび6 μLトランスフェクション試薬に2 μgのプラスミドDNA(デオキシリボ核酸)の溶液を調製します。
   2. 15分間のインキュベーション後、溶液を細胞に静かに(滴下して)加えます。
7. 寒天ブリッジの準備
   1. 50mLの滅菌塩化ナトリウム溶液(140 mM)に0.75 gのアガロースを加え、電子レンジで加熱して溶解します><。 注:寒天ブリッジ調製用の2 - 3 M KClは、高濃度(ブリッジからの一定の拡散など)とK+イオンとCl-イオンの等な移動度によりLJPをさらに減少させますが、イオン(特にCl-)の浴溶液への漏れを最小限に抑えるために回避されました。
   2. 10 μLのピペットチップ(または小径ホース)にシリンジを使用して液体アガロース溶液を充填します
      手記：ブリッジ内の気泡を避けてください。
   3. 寒天ブリッジを冷却して固化させた後、無菌の140 mM塩化ナトリウム溶液で保存します。
8. 記録電極と入浴電極を準備します。​
   1. パッチクランプセットアップのバスと記録電極から銀線を取り外します。
   2. ワイヤーをサンドペーパーで磨いて、以前の実験から塩化銀を取り除きます。きれいな銀線を3 M KClに浸し、1.5 Vバッテリーの正極に接続して、塩化銀で電解コーティングします><。 注意: バッテリーの代わりにラボの電源を使用できます。
9. ガラスキャピラリーから低抵抗のパッチピペット(1.5-3.0MΩ)をマイクロピペットプーラーで引き抜き、ファイヤーポリッシュします。ピペットは測定日のためにほこりをかぶらないように保管してください。
10. 録音の30分前に、すべてのセットアップコンポーネントをオンにして、動作温度まで加熱します。バッファーが室温にあることを確認します。

2. 選択性測定

1. 細胞の一過性トランスフェクションの24〜48時間後に記録を開始します。
2. 測定チャンバーにカバースリップを1枚入れ、シリコンで密封して外部バッファの漏れを防ぎます。ペトリ皿を他のカバースリップと一緒にインキュベーターに保管し、次の一連の実験に備えます。
3. 細胞の剥離を防ぐためにチャンバーに細胞外バッファー(高[Cl-])を慎重に充填し、顕微鏡の下に置き、40倍対物レンズを使用して細胞を視覚化します。
4. 浴電極に寒天ブリッジを取り付け、液面センサーと浴ハンドラーの灌流出口と一緒にチャンバー内に配置します。
5. 細胞外溶液を1 mLの新鮮な外部溶液(高[Cl-])と2回交換して、残留培地と分離した細胞を除去します。
6. 細胞に焦点を合わせ、他の細胞から単離する必要があるトランスフェクション(蛍光)細胞を検索します。トリプルバンドフィルターセットとオレンジ色の光(590 nm、帯域幅15 nm、強度100%)を使用して、mCherryを励起して視覚化します
   手記： HEK細胞は、ギャップ結合によって隣接する細胞と電気的に結合できるため、細胞全体の構成で膜抵抗が低くなります。
7. 引っ張ったピペットの1つに細胞内溶液を入れ、ピペットを数回ひっくり返して気泡を取り除きます。
8. ピペットをピペットホルダーに取り付け、先端の目詰まりを防ぐために正圧を加えます。
9. 顕微鏡下でパッチピペットの先端の位置を特定し、マイクロマニピュレーターを使用して細胞の近くでナビゲートします
   手記：次の手順は、材料リストに記載されているアンプ、データ集録、および評価ソフトウェアに適用されます。
10. データ収集ソフトウェアで「メンブレンテスト」を開始し、電圧ステップ(テストパルス;例:5 mVで10 ms、ベースラインは0 mV)、データ収集ソフトウェアで「膜試験」を実行しながら、「バスモード」を使用して手動または指定ソフトウェアを介して自動的に行います。
11. ピペット抵抗が目的の範囲(1.5〜3.0MΩ)にあることを確認してください。
12. 「メンブレンテスト」の「バスモード」で作業中にアンプのピペットオフセットノブを回してピペット電位を調整することにより、オフセット電流をゼロにします。
13. 全セル構成でパッチを確立します。
    注意: 次の手順では、使用済みのピペットホルダーのサイドポートに正圧と負圧を適用する必要があります。これは、シリンジ、マウスピース、または電子制御圧力調整器のいずれかを使用して行うことができます。このプロトコルでは、マウスピースを介して正圧と負圧が加えられます。
    1. パッチピペットで上からゆっくりと細胞に近づき、触れる直前に陽圧をほぐします。
       注:先端がセルに近づくと、抵抗はわずかに上昇します。これは、テストパルスのサイズが小さくなったことで示されます。
    2. 「メンブレンテスト」を「バスモード」から「パッチモード」に変更して、保持電位を細胞の予想される静止電位(-30〜-40 mV)に変更します。
    3. 場合によっては、セルに付着した構成は、正圧の解放後にそれ自体を形成します。そうでない場合は、ギガシールの形成を助けるために静かに陰圧を加えてください.
       手記： セル結合型構成は、テストパルスがパルスの開始時と終了時に2つの小さな容量性ピークに減少し、膜抵抗がGΩの範囲にある場合に確立されます。-60mVまでの負電圧は、ギガシールの形成を容易にする可能性があります。
    4. 「ピペット容量補正」ノブを回してピペット容量を補正し、テストパルスのフラットな応答を取得します。
    5. 負圧または強度を増す負圧の短いパルスを加えることにより、シールを破壊せずにパッチを破裂させ、全細胞の立体配座を得る
       手記： 細胞結合型から全細胞型への移行が成功すると、容量性ピークが増加します。
    6. 全細胞パラメータと使用済みアンプの補償調整を設定して直列抵抗補償を適用し、膜電位を目的の保持電圧に正確にクランプします。
       1. 「膜試験」を「全細胞」モードに切り替え、「直列抵抗補償」パネルで「予測」と「補正」を最大90%オンにし、オーバーシュートと容量性応答の振動を回避し、全細胞補償スイッチをオンにし、適切なフロントパネルのノブで全細胞パラメータを調整します amplifierの反復的な方法で、理想的にはフラットテストシール応答.
          手記： 直列抵抗の補償と補正の詳細については、この手順がメーカーによって異なるため、アンプのマニュアルまたはガイドラインを参照してください。
    7. 全細胞構成を確立した後、少なくとも2分間待ってから記録し、パッチピペットを介して細胞内溶液を十分に交換します。
14. 以前に(1.2で)設定したプロトコルを使用して、さまざまな保持電位で光誘起電流を記録します。
15. 細胞外緩衝液をチャンバー内で少なくとも5回、パッチを破壊せずに低[Cl-]に交換し、新しい塩化物濃度で別の電流-電圧関係(ステップ1.2参照)を記録します
    手記： 自動バッファー交換用の灌流システムは、このプロセスを容易にしますが、必須ではありません。
16. テストするすべてのイオン条件について2.15を繰り返しますが、上記の「膜テスト」によって測定間のパッチの品質を繰り返しチェックします。
    手記： 正確な膜電圧と安定した細胞内イオン組成を保証するためには、膜抵抗は500MΩ以上であるべきであるが、アクセス抵抗は10MΩを超えてはならない、2.12.6参照)。メンブレンテストでは、全細胞パラメータ補正をオフにすることを忘れないでください。
17. 複数の細胞について2.2.から2.15.を繰り返しますが、細胞の健康性を確保するために、テストシリーズごとに新しいカバースリップを取ります。

>表1:緩衝液のイオン組成。HEK細胞における塩化物選択性実験のための細胞内(intra.)および細胞外(extra.)緩衝液の組成。使用される略語:エチレングリコール四酢酸(EGTA)、4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)、アスパラギン酸(ASP)。すべての濃度はmM単位です。