光依存性イオンチャネルを持つ細胞の光遺伝学的電気生理学記録

要約

出典:Grimm, C., et al.チャネルロドプシンのイオン選択性の電気生理学的測定のための全細胞パッチクランプ記録。J. Vis. Exp.(2017年)

この動画では、光依存性のイオンチャネルタンパク質を発現した胚性腎臓細胞培養物を蛍光レポーターと融合させ、イオンの動きに対する光の影響を実演しています。全細胞パッチクランプは、イオンの動きを監視するために使用されます。

プロトコル

1. 録音前の設定

1. 表1に示すように、イオン濃度で記録溶液を調製します。​
   1. 超純水中の2 Mストック溶液15 mLを調製し、MgCl₂、CaCl₂、KCl、およびCsClについて調製します。
   2. 表1に従って、細胞内緩衝液100 mLと細胞外緩衝液500 mLの固体成分を別々のビーカーに秤量し、その後、調製したストック溶液をそれぞれの量に加えます。例えば、細胞内バッファーには、0.3803 g(10 mM)EGTA(エチレングリコール四酢酸)、0.2383 g(10 mM)HEPES(4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸)および0.6428 g(110 mM)NaClを使用し、2 M MgCl₂およびCaCl₂を100 μL、2 M KClおよびCsClストック溶液を50 μL添加します。
   3. 超純水を加え、測定を妨げない、つまりクエン酸やN-メチル-D-グルカミン(NMG+)などのChR(チャネルロドプシン)によって伝導されない酸と塩基を使用してpHを慎重に調整します。
   4. 浸透圧を細胞内溶液で 290 mOsm に調整し、glucose.
      を含む細胞外溶液で浸透圧を 320 mOsm に調整します。 ....

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
HEK293細胞	シグマ・アルドリッチ	85120602	ヒト胚性腎臓細胞
網膜	シグマ・アルドリッチ	R2500	オールトランスレチナール
フージーンHD	プロメガ	E2312	トランスフェクション試薬
DMEM	バイオクローム	FG 0445	ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム
アガロース	ロス	3810	寒天橋
CaCl2	ロス	5239	CaCl2 2H2O
セシCl	バイオモール	2452
エグタ	ロス	3054
FBSの	バイオクローム	S0615	細胞培養
グルコース	ロス	HN06	D(+)-グルコース
KClの	ロス	6781
MgCl2	ロス	2189	MgCl2 6H2O
NaCl	ロス	3957
NMGの	シグマ・アルドリッチ	M2004	N-メチル-D-グルカミン
Na-アスパラギン酸	シグマ・アルドリッチ	A6683の	L-アスパラギン酸ナトリウム塩一水和物
クエン酸	ロス	6490
エイジI	サーモフィッシャーサイエンティフィック	ER1462	制限酵素
ショイ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	ER0695	制限酵素
ンヘイ	サーモフィッシャーサイエンティフィック	ER0975	制限酵素
XL1Blue 大腸菌/	アジレント・テクノロジーズ	200249	ケモコンピテント大腸菌
カナマイシン	ロス	T832
リソジェニーブロスミディアム	ロス	X964
寒天	ロス	6494	寒天プレート
プラスミド精製キット	マルケリー・ナーゲル	740727年25月
ペニシリン/ストレプトマイシン	バイオクローム	Aの2213	細胞培養
ポリ-D-リジン臭化水素酸塩	シグマ・アルドリッチ	P6407-5MG	カバースリップコーティング
マイクロフォージ	カスタムメイド		火磨き
血清ピペット	TPPとは		さまざまなサイズ
クリーンベンチ	コジャイール	バイオウィザードSL130
スターラー	イカ	RCTクラシック
シルバーワイヤー	サイエンス製品	AG-T25;AG-T10	電極、0.64 mm(バス)、0.25 mm(電極)
pHメーター	小物	765カリメトリック
浸透圧計	フォーゲル	OM815
顕微鏡	カールツァイス	ID03	火磨き
CO2インキュベーター	バインダー	CB150
細胞培養皿	TPPとは	93040	内径34mm
カバースリップ	ロス	P232	直径15mm
温度計	Rössel Messtechnik	MTM12
ビームスプリッター	彩度	21011	90/10トランスミッション
ピペットホルダー	ALA科学機器	PPH-1P-AXU-0-1.5
ヘッドステージ	分子デバイス	CV203BU
増幅器	分子デバイス	アクソパッチ200B
デジタイザー	分子デバイス	デジデータ1400	デジタルアナログコンバータ
光源	TILL Photonics(ティルフォトニクス)	ポリクロームV	全輝度540nmに設定
顕微鏡	カールツァイス	アクシビボルト100
シャッター	ヴィンセント・アソシエイツ	VS25
シャッタードライバー	ヴィンセント・アソシエイツ	VCM-D1
ガラスのキャピラリー	ワーナー・インストゥルメンツ	G150F-3	ファイヤーポリッシュエンド付きホウケイ酸キャピラリー OD 1.5 mm ID 0.86 mm
マイクロピペットプーラー	サッターインストゥルメント	P1000
バスハンドラー	ローレンツ・メスゲラテバウ	MPCU
トリプルバンドフィルターセット	彩度	69008	蛍光フィルター ECFP/EYFP/mCherry
CCDカメラ	ワテック	ワット-221SCCD
オプトメーター	ギガヘルツオプティック	P9710	光強度の測定
目的	カールツァイス	421462から9900から000	W プランアポクロマート 40X/1.0 DIC
マイクロマニピュレーター	サイエンティフィカ	パッチスター
録音室	カスタムメイド
電源	マンソン	HCS-3202	顕微鏡内蔵電源からの電気ノイズを回避
防振テーブル	ニューポート	M-VW-3636-OPT-01
ファラデーケージ	カスタムメイドまたは任意の商用マッチングテーブル
ホース	任意の商業施設(例:Roth)		浴の取り扱いとピペット圧力の適用のためのさまざまなサイズと材料、寒天ブリッジ
リニアシェーカー	サンラボ機器	SU 1000
液路電位計算機	Molecular DevicesまたはPeter H. Barryから直接		プログラムはClampex取得ソフトウェアに含まれているか、p.barry@unsw.edu.au から取得できます
データ収集ソフトウェア	分子デバイス	クランペックス 10.X
データ評価ソフトウェア	分子デバイス	クランプフィット 10.X
PsACR1	GenBankまたはAddgene	KF992074.1 または Addgene plasmid #85465	PsACR1の遺伝子コード化
アンプガイド	分子デバイス	軸索ガイド

の 名 名 名 名 シリーズ 名 名 の 年 の 名 の 名 シリーズ の の 型 年 の の の 型 の