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1. 録音
>注:この手順では、分離された神経節からのパッチクランプ録音は、通常、めっきの12〜24時間後に実行されます。他の研究室では、培養期間がはるかに長い後のニューロンからの結果が報告されています。
- 録音チャンバーを準備します
- クイック交換記録チャンバー(または同等のもの)を使用して、培養皿内で直接パッチクランプ録音を行うことができます。倒立顕微鏡にチャンバーをセットします。
- ガラス底の培養皿をチャンバーに挿入します。
- L-15溶液を灌流チューブシステムを介して記録チャンバーに供給します。チャンバー内の灌流インフローとアウトフローを1分あたり0.5〜1mLの速度で安定させます。
- 電極を装填するための内部溶液を準備します
- 穴あきパッチ内部溶液のアリコートを解凍します。2.5 mLの溶液を35 mmの培養皿に割り付けます。培養皿の蓋を元に戻し、「Tip Dip」とラベルを付けます。このソリューションをできるだけ清潔に保つことが非常に重要であるため、ほこりのないゾーンに置いておきます。
- 1 mgのアムホテリシン-Bを秤量し、20 μLのジメチルスルホキシド(DMSO)を加えます。すべてのアムホテリシン-Bが溶液中に入るまで、溶液をボルテックスしてスピンダウンします。解凍した穿孔パッチ内部溶液の残りの2 mLに、DMSO/アムホテリシン-B溶液10 μLを加えます。溶液をピペットで2〜3回引き出して排出し、DMSO/アンホテリシン-Bが内部溶液に均一に混合されていることを確認します。溶液はマイルドな黄色がかった色合いになります。
- アンホテリシンB穿孔パッチ内部溶液を3mLシリンジに引き込みます。シリンジに34Gチップを追加します。シリンジをアルミホイルで包み、シリンジを氷の上に保ちます.
手記：この溶液は、細胞膜の穿孔におけるアムホテリシン-Bの有効性を確保するために、2時間ごとに作り直す必要があります。アムホテリシン-Bは光感受性であり、アルミホイルまたはその他の方法を使用して光から保護する必要があります。
- パッチクランプ録音
- 10倍または20倍の対物レンズを使用してニューロンを可視化します。照明を調整し、光学系を最適化して、セルの周囲の境界と影を確認します。
- 分離されたニューロンの品質を確認します。コントラストが強すぎず、小さく分散したクレーターのみを持つ、滑らかで均一な表面を持つニューロンのみを試してください。また、ニューロンのペア、破片に囲まれたニューロン、または他の細胞を避けるようにしてください。
- 100倍の倍率で、パッチするニューロンまたはニューロンのフィールドを特定し、視野の中央に並べます。
- ピペットの先端をアンホテリシンを含まない清浄な溶液で満たし、培養皿に入れた清浄な溶液にチップを浸します(~20秒間)。毛細管現象により、少量の溶液が先端に引き込まれます.
手記：このステップを実体解剖顕微鏡で行うと、チップがTip Dip溶液をどれだけ保持しているかを判断できます。溶液が 10 ~ 20 秒間保持されない場合、電極の形状は理想的ではありません。この場合、電極引きプログラムを再構成して、より長い先端を生成します。
- 次に、ピペットの背面にアムホテリシンを含む内部溶液を入れます。ピペット内のフィラメントは、チップ内のクリーンな溶液に合うように溶液を引き下げます。フィラメントが溶液をスムーズに引き下げるのを待ち、気泡をタップアウトしようとしないでください。
- シリンジを使用して、電極の一番後ろにある可能性のある溶液を引き出します.
手記：このポイントから着地し、目的のセルに高抵抗シールを形成するまで、迅速に作業することが非常に重要です。
- ピペットをピペットホルダーに挿入します。ピペットのドリフトを防ぐために、ピペットがホルダーにぴったりと収まっていることを確認してください。ピペットが安定していない場合は、ピペットホルダーの前面と背面にあるシーリングOリングを交換して、ドリフトを最小限に抑え、強力な吸引を維持します。ピペットを新しく充填されたものと交換します。
- ピペットを録音チャンバーの浴槽に下げます。
- ピペットチップを視野の中央に配置します。先端に気泡やその他の破片がないことを確認してください。
- メンブレンテストで電圧ステップ(5 mV)を印加して、ピペット抵抗を監視します。セルにシールを形成するプロセス全体を通じて、入力抵抗を監視し続けます。
- pClampのメンブレンテストモードでピペット電流がゼロを示すように、ピペットオフセット電位をキャンセルします。
- パッチクランプアンプの高速静電容量補正機能を使用して、ピペットの静電容量を補正します(Multiclamp CommanderソフトパネルのCp高速ダイヤル)。
- ピペットをセルまで下に移動します。
- ピペットがニューロンに十分に近づいたら、高倍率の対物レンズに切り替えて、カメラを介して画像をモニターに送信します(対物レンズ40倍、合計倍率400倍を使用)。ピペットを調整し、ニューロンを再び中心に据えます。
- 記録電極を体細胞に近づけます。モニター上のニューロンの中心を特定し、記録電極をニューロンの上に配置します。
- 電極が球状細胞の中心に着地するように、ニューロンに上から近づきます。ピペットのオフセットを調整して、システム内の一定のDC電位をゼロにします。
- ピペットをメンブレンの近くに置きます。セルの中央にしっかりと着地します.
手記：着地時には、ニューロンの表面に小さなくぼみが生じ、入力抵抗が2倍/3倍になります。
- シリンジまたはマウスピペットを使用して陰圧(吸引)を加えます。-60mVの保持電位をオンにします。シール抵抗は、ギガオーム
を超えるまで増加するはずです。
手記：迅速に作業して、電極の充填からセルへの着地までの時間を短縮します。穿孔パッチ内部溶液に添加されたアンホテリシンが電極先端に到達するまでの時間は限られています。チップがアンホテリシンで汚染されると、高抵抗のシールを形成するのが難しく、抵抗はしばしば~200メガオームにまで横ばいになります。
- ギガオームシールが形成されたら、負圧を解放します。シールが形成されたらすぐに、高速静電容量補償を適用して、メンブレンテストモードでのピペット容量過渡現象の振幅をできるだけ小さくします。
- アンホテリシンが働き始めると、入力抵抗がゆっくりと減少し、アンホテリシンがメンブレンに入るにつれて5mVの電圧ステップに応答して流れる電流が徐々に増加するのを見てください。漸進的な安定化ではなく、直列抵抗の突然の減少は、自然破壊が起こったことを示唆しています。
- アンプの容量性トランジェント・ヌル機能を使用して、セル全体の容量と直列抵抗を推定します。実験の開始時および実験中に定期的に、級数抵抗を文書化し、監視します.
手記：直列抵抗は、電極のサイズとピペットに引き込まれる清浄な溶液の量にもよりますが、安定するまでに5〜20分かかる場合があります。電圧クランプモードと電流クランプモードは、直列抵抗が30メガオーム未満で安定すると使用できます。記録中のニューロンの腫脹または縮小が観察されることがありますが、溶液の浸透圧とpHが正しく調整されている場合、まれに観察されます。