自由に動くラットの子犬における脳波計による誘発発作の記録

要約

出典:Huo, Q. et al. Recording EEG in Freely Moving Neonatal Rats Using a Novel Method. J. Vis. Exp. (2017)

このビデオは、発作誘発性のラットの子犬からの脳波(EEG)信号の記録を示しています。データ収集システムに接続された電極が埋め込まれた自由に動く子犬を例にとってみましょう。てんかん発作を誘発するために神経毒を投与し、その結果生じる電気的破裂活動をEEG信号を用いてモニターします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 電極の準備 (図 1A-C)

>注:コンピューターのピン軌跡は、通信デバイスの信号インターフェースの一部としての単なる突起接点です。これは、メスコネクタに差し込むオスコネクタで構成されています。

1. はさみを使用して、オスピンとメスピンをコンピューターのピン軌跡(図1A)から慎重に分離します。オスピンとメスピンを接続して電極を形成し、シアノアクリレートを塗布して強力な接着結合を作成します(図1C)。
2. 蒸留水で満たされたビーカーに電極を入れ、超音波洗浄機に10分間置き、45°Cの乾燥オーブンに30分間移動させ、紫外線(UV)光を使用して電極を30分間滅菌します。

2. 外科的処置(図1D-F)

1. 滅菌した手術器具と脳定位固定装置を準備します。イソフルラン麻酔(2.5%)と空気を使用して、新生児ラットの子犬に麻酔をかけます。子犬が深く麻酔をかけられたら、イソフルランの用量を1.0%に調整します。手術前に尻尾やつま先をつまんで、適切な麻酔の深さを確保してください。
2. 子犬の頭部を固定するために、耳のバールを外耳道に入れ、それらをわずかに締めます。
   手記：新生児の頭蓋骨は非常に柔らかいため、イヤーバーを過度に締めないでください。
3. すべての機器に70%エタノールを噴霧することにより、無菌の手術野を維持します。メスを使用して頭に15mmの切開を行います。鉗子を使用して、頭皮を四隅の正中線からそっと引き離します。食塩水に浸した綿を皮膚の下に入れて、切開部を大きく開いたままにします(図1D)。
4. 頭蓋骨のブレグマとラムダのポイントを見つけて、鉛筆で印を付けます。注射針(26 G)を使用して、前頭前野(PFC)と海馬に2つのバリ穴を開けます><。 手記：PFCはブレグマの後方+1.8 mm、正中線の横方向に-0.5 mmの位置にあり、海馬はブレグマの前方に-2.0 mm、正中線から横方向に±.5 mmの位置にあります(図1DおよびE)。電極の深さは、脳の損傷を最小限に抑えるために、皮質表面から2mm以上下にしてはいけません。
5. 鉗子を使用して電極を保持し、参照電極と記録電極をそれぞれPFCと海馬に挿入します。エリスロマイシン軟膏を電極の周りに塗布して、感染の可能性を回避します。.電極をシアノアクリレートで固定します。
6. 歯科用アクリルセメントは、接着剤と粘性のある粘稠度を持つように準備します。電極と頭蓋骨の残りの部分を覆うように歯科用セメントを塗布します.
   手記：デンタルセメントを塗布する前に、頭蓋骨を完全に乾かしてください。
7. 電極を保護するために5%ピクリン酸を塗布します
   手記：すべての手順は、無菌状態を維持するためにバイオセーフティフードで行う必要があります。
8. 動物を定位固定装置フレームから取り外し、300μLの10%グルコースを皮下注射します。回復のために加熱した毛布の上に置きます。動物が暖かく(37°C)、歩行可能(つまり、完全に回復)していることを確認してください。術後の痛みに対してブプレノルフィンを腹腔内(0.05 mg / kg)に投与します.
   手記：動物が十分な意識を取り戻すまで(つまり、正常な行動と動き)、動物を放置しないでください。
9. 子犬が意識を取り戻した後、子犬をダムと一緒に家のケージに戻します。動物が完全に回復するまで2日間待ちます。

3. 脳波記録

1. 完全に回復した後、子犬の頭蓋骨に埋め込まれた電極を自身のケージ内のアンプに接続します。アンプをアナログ-デジタルコンバーターに接続し、コンバーターをコンピューターに接続します。接続線は、絡まらないように慎重に扱う必要があります。
2. 録音用のデータ収集ユニットで少なくとも10,000Hzのサンプリングレートを選択します(送信機の帯域幅は1〜100Hzです)。データが適切にサンプリングされていることを確認します。
3. ベースライン記録を取得した後、子犬にカイニン酸 (KA、2 mg/kg) を腹腔内注射しててんかん発作を誘発します。KA 注射の 15 分後に、てんかんの分泌物を観察して記録します。KA を介した発作は通常、物理的です。
   注:発作強直時間は約15.2 ±0.9秒、発作時間は約62±5秒です。新生仔ラットの発作は、クロラール水和物(400 mg / kg)のIP注射を行うことで予防できます。
4. デジタル化したデータを保存し、spike2などの信号処理ソフトウェアパッケージを使用して解析します。パワースペクトル解析を行うことにより、新生児EEG信号のさまざまな周波数成分のパワーレベルを明らかにします。1〜100 Hz(EEGバンド)の二乗平均平方根の振幅を見つけて、1分間の時間枠でパワーを計算します。

結果

図1:外科的移植プロトコルの図(A)小さなコンピュータピン。(B)メスピン(左)とオスピン(右)。スケールバーは、メスピンの長さを測定するために使用されます。(C)メスピンとオスピンを接続します。(D)露出した頭蓋骨。1番は参照サイト、2番はブレグマ、3番と4番は収録サイト、5番はラムダです。(E)電極の埋め込み。No.1は基準電極を、No.3とNo.4は記録電極を提示。(F)回収されたラットの子犬(P9)。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
コンピュータピン
挟撃	DELI Group Co., Ltd.(デリグループ株式会社)
502瞬間接着剤	DELI Group Co., Ltd.(デリグループ株式会社)	7144
乾燥炉	ボクソン	GZX-9140MBEの
イソフルオラン	RWDライフサイエンス	〒902-0000-522
脳定位固定装置	RWDライフサイエンス	〒900-0068-507
麻酔器具	RWDライフサイエンス	〒902-0000-510
ホメオサーミック加熱装置	ハーバード大学装置	Kの024509
アンプ Model 3000	A-Mシステムズ	61558
Micro1401アナログデジタルコンバータ	ケンブリッジ・エレクトロニック・デザイン・リミテッド	4383	データ収集ユニット
スパイク2	ケンブリッジ・エレクトロニック・デザイン・リミテッド

名 名