急性脳切片におけるニューロン接続のペアパッチクランプ記録

要約

出典:Qi, G., et al.対パッチクランプ記録を用いた急性脳切片におけるニューロン微小回路の電気生理学的および形態学的特性評価。J. Vis. Exp.(2015年)

このビデオでは、脳スライスを固定し、ピペットを配置して全細胞構成を実現し、シナプス前ニューロンを刺激してシナプス後応答を記録することで、ニューロンの接続性を解明する手順を示しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. ペアパッチクランプ記録とバイオサイトン充填

シナプス結合のタイプに応じて、シナプス結合ニューロンを見つけるために3つの異なるアプローチが使用されます。接続確率が低い場合 (ほとんどの興奮性接続で予想されるように)、次の手順に従ってください。

1. 接続性が低いニューロン接続
   1. パッチピペットに、表1に記載されている組成の内部溶液を入れます。全細胞構成のすべての記録について、3〜5 mg/mlの濃度のバイオシチンを内部(ピペット)溶液に添加して、シナプス前およびシナプス後ニューロンの良好な染色結果を得ます。ビオシチンを細胞内に少なくとも15〜30分間拡散させます（ニューロンのサイズによって異なります）
      注:下記の「検索」ピペットで使用される溶液にバイオシチンを追加しないでください。
   2. 全細胞モードで推定されるシナプス後ニューロンにパッチを当てます。長くて細いシャンクのパッチピペットを使用してください。これにより、対物レンズの下でのピペットの操作性が向上し、電極がスライスに導入されたときに発生する可能性のある動きのアーチファクトが減少します。
   3. 次に、8〜10MΩの抵抗と小さな先端径の「探索」パッチピペットを使用して、細胞付着した配置で潜在的なシナプス前ニューロンにパッチを当てます。これらのピペットは、「緩い」細胞付着パッチを確立します。「検索」ピペットに、シナプス前細胞の検索中にニューロンが脱分極するのを防ぐために、K ⁺がNa⁺に置き換えられた内部溶液(表2)を入れます><。 注:「緩い」シール抵抗はGΩの範囲ではなく、通常は約30〜300MΩです。
   4. 電流クランプモードで、「ルーズ」シールの下の膜電位を約-30〜-60mVに保持します。次に、大きな電流パルス(0.2 - 2 nA)を印加して、電位シナプス前細胞に活動電位を引き出します。この活動電位を電圧応答の小さな小穂として観察します。
   5. シナプス後反応の低下を防ぐために、刺激周波数を0.1Hzに設定します。脳組織が非常に未熟であるか、シナプス接続があまり信頼できない場合は、より低い刺激周波数を使用してください。
   6. 「シナプス後」ニューロンがテストされた「シナプス前」ニューロンの刺激に反応しない場合は、「ルーズ」シールモードで新しいニューロンにパッチを当てます。「検索」パッチ電極は、>30MΩの抵抗を持つシールが確立されている限り交換しないでください。このようにして、シナプス前ニューロンの可能性のある最大30個をテストします.
      手記：パッチクランプを緩めて検索手順中にニューロンを損傷しないようにするには、全細胞パッチピペットに適用される吸引と比較して、検索ピペットには穏やかな吸引のみを適用する必要があります。
   7. 「ルーズ」シールモードでの刺激により、シナプス後ニューロンの潜時が<5ミリ秒のEPSP/IPSP(興奮性シナプス後電位/抑制性シナプス後電位)が生じる場合は、シナプス前ニューロンから「検索」ピペットを取り外してください。
   8. 「検索」パッチピペットを、ビオシチンを含む通常の内部溶液で満たされたパッチ電極と交換します。この記録パッチピペットの抵抗が4〜8MΩであることを確認してください。SOMAサイズが大きいほど、電極抵抗を低くすることができます。
   9. シナプス前ニューロンにパッチを当て、全細胞電流クランプモードで記録します。シナプス前ニューロンへの電流注入により活動電位を誘発し、シナプス後応答を記録します。データをコンピューターに保存して、後でオフラインで分析します。

>表 1.低塩化物ピペット溶液。

名 名 名

	ミリメートル	g/L	グラム/50ml
K-グルコン酸	135	31.622	1.5811
KClの	4	0.298	0.0149
ヘープス	10	2.384	0.1192
クレアチンリン酸	10	2.552	0.1276
ATP-Mg2+	4	2.028	0.1014
GTP-NAの	0.3	0.156	0.0078
KOHでpHを7.3に調整します
浸透圧 ~300 mOsmol/L
3 - 5 mg/mlのバイオシチンを追加

>表 2.シナプス結合ニューロンを検索するための高Naピペット溶液。

名 の 名 名 名 します

	ミリメートル	g/L	グラム/50ml
Na-グルコン酸	105	22円92銭	1.146
NaCl	30	1.76	0.088
ヘープス	10	2.384	0.1192
クレアチンリン酸	10	2.552	0.1276
ATP-Mg2+	4	2.028	0.1014
GTP-NAの	0.3	0.156	0.0078
NaOHでpHを7.3に調整
浸透圧 ~300 mOsmol/L

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
増幅器	ヘカ	EPC 10 USBトリプル	2-3プリアンプ付き
顕微鏡	オリンポス	BX51WI	2つのカメラポートと4×対物レンズ、40×水浸対物レンズ
カメラ	TILL Photonics(ティルフォトニクス)	VX55	赤外線CCDカメラ
ワークステーション	ルイグス&ノイマン	赤外線240	電動XYステージと顕微鏡用の電動フォーカス軸付き
マイクロマニピュレーター	ルイグス&ノイマン	SM-5	X-Y-Zマニピュレーター(2-3プリアンプ用)
ファラデーケージ	ルイグス&ノイマン
防振テーブル	ニューポートスペクトル物理学
パッチマスター	ヘカ
ミクロトーム	マイクロムインターナショナル	HM650Vの
マイクロピペットプーラー	ヘカ	サッターP-97
ニューロルシダシステム	微小明視野		NeurolucidaおよびNeuroexplorerソフトウェアを使用

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