Intact Rat背根神経節の全細胞パッチクランプ記録

要約

出典:Gong, K.,et al.成体ラットの無傷の背根神経節のパッチクランプ録音。J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオは、パッチクランプ技術を使用してレオベースと膜電位を測定し、増分電流注入に対するニューロンの応答を分析する後根神経節の感覚ニューロン興奮性の調査を示しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。  

1. パッチクランプ録音

1. 電極溶液(表1を参照)を氷の上に置いて、劣化を防ぎます。ガラスパッチピペットに濾過した細胞内溶液(シリンジフィルター、細孔径:0.2μm)を充填し、ヘッドステージピペットホルダーに入れます。ピペットを浴液に下げる前に、プランジャーを約1ml変位させることにより、5mlシリンジを介してピペットに穏やかな陽圧を加えます><。 注:これにより、ピペットが詰まるのを防ぎます。
2. 「Vクランプ」モードを選択して、のモードノブを回します amplifier、次にソフトウェアの「メンブレンテスト」インターフェースを開きます。顕微鏡検査でピペットをターゲットニューロンに近づけます.
   手記： インタクトDRG調製では、サテライトグリア細胞の薄層が各ニューロンをカプセル化します。
3. ピペットからの陽圧を使用して、ニューロンとサテライトグリア細胞の周囲の層との間の空間の突然の拡大が観察されるまで、サテライトグリア細胞層を横切ります。ニューロンに「くぼみ」が観察されるまで、ピペットをニューロンに向かって動かし続けます.
   手記： 解離したニューロンからの記録と比較して、陽圧はわずかに大きくする必要があり、これにより衛星グリア細胞層に浸透し、パッチングが成功する可能性が高まります。
4. 陽圧を下げます。次に、穏やかな吸引力でギガオームシールを実現します.
   手記：この方法では、録音成功率は少なくとも70%です。
5. 前述のように全細胞記録構成を取得します。
   1. 短くて強い吸引によってニューロン細胞膜に短時間浸透します。または、吸引が適用された状態でアンプの「ザップ」機能を使用します。
   2. 全セルモードが確立されたら、アンプの静電容量と抵抗補償ノブを回して、全セルの静電容量と直列抵抗(Rs)を補償します。
      手記：Rsは通常5〜20MΩです。
   3. 記録中にRsが最初に30MΩより大きいか、または20%以上変化した場合は、セルを放棄します。また、静止膜電位を測定します。セルが -50 mV を超える場合は、セルを破棄します。
6. 「メンブレンテスト」ウィンドウを閉じます。「I-clamp ノーマル」モードを選択するには、 amplifierのモードノブ。
7. ソフトウェアの「オープンプロトコル」をクリックし、レオベースを測定するためのプロトコルを選択してロードします。「録音」をクリックして録音を開始します。入力抵抗とレオベースを測定し、100 pA刻みで段階的な一連の脱分極電流を注入することにより、ニューロンの興奮性を調べます。
   1. ソフトウェアの「オープンプロトコル」をクリックし、レオベースを測定するためのプロトコルを選択してロードします。「録音」をクリックして録音を開始します。入力抵抗とレオベースを測定し、100 pA刻みで段階的な一連の脱分極電流を注入することにより、ニューロンの興奮性を調べます。
   2. データ収集および分析ソフトウェア(Clampfitなど)を使用して、メーカーの指示に従って記録されたトレースを分析します。このソフトウェアは、過分極電流が供給される際の定常状態のI-V関係に基づいて入力抵抗(Rin)を計算します。カーソルを動かして、レオベースと膜の閾値の値を測定します。手記： APを誘導するために必要な電流の振幅はレオベースとして定義され、APを誘導するための最低電圧は膜閾値として定義されます。
8. 配位子誘起電流を記録します。
   1. ピペットに特定のアゴニストを入れます
      注:今回の報告では、100 μM グルタミン酸と 100 μM AITC を使用して、それぞれグルタミン酸受容体と TRPA1 受容体によって媒介される電流を誘導しました。
   2. ピペットをチェックして、内部に気泡がないことを確認します。ピペットをピペットホルダーに入れます。ピペットホルダーを薬剤分配システムに接続されたチューブに接続します。
   3. マニピュレーターを使用して、ニューロンから50μm以内でピペットを動かします。薬剤分配システムの圧力を1 psiに、持続時間を1秒に設定します。記録モードを電圧に切り替えますamp、およびclamp -70mVで。薬剤分配システムを介して圧力を短時間加えて、薬剤誘発電流を記録します。

表 1

名 名 名 名

100mlの細胞内溶液
濃度(mM)	コンポーネント	MWの	g
130	Kクルーコン	234.24
10	KClの	74円55銭
10	ヘープス	238.3
10	エグタ
2	MgCl2*6H2O	203.3
注:KOHでpHを7.4に調整し、ショ糖と蒸留水で浸透圧を260〜280mOsmに調整します。2 mM MgATP、0.5 mM Na2GTPを添加し、すぐに使用する前にろ過します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ガラス製ピペット	サッター	BF150-110-7.5
錨	ハーバード装置	〒64-0250	ドリフトを避けるためにDRGを安定させます。
蠕動ポンプ	WPIの
ピペットプーラー	サッター	P97
増幅器	分子デバイス	アクソパッチ 200B
デジタイザー	分子デバイス	1440D
顕微鏡	ニコン	FN600
マイクロマニピュレーター	サッター	MPC200
カルボゲン(95%O2、5%CO2)	地元の医療ガス供給業者

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