マウス蝸牛の特定の周波数領域におけるリボンシナプスの評価

要約

出典: Yu, S., et al. Morphological and Functional Evaluation of Ribbon Synapses at Specific Frequency regions of the Mouse Cochlea. J. Vis. Exp. (2019年)。

このビデオでは、マウス蝸牛の特定の領域にあるリボンシナプスを評価する方法を示します。免疫染色と共焦点イメージング技術を利用して、各蝸牛回転の異なる周波数領域にわたる機能的なシナプスを同定します。

プロトコル

動物の取り扱いに関するすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って行われています。

1. 動物の選択

1. すべての実験において、成体C57BL/6J雄マウス(8週齢)を動物モデルとして用いてください><。 注:Cdh23のスプライスバリアントを保有するC57BL/6Jマウスは、聴覚系の老化が加速し、蝸牛の基底回転でリボンシナプスが40%失われ、中回転で10%減少し、生後6か月までに、年齢とともに蝸牛全体でこの損失が急速に増加します。したがって、6か月以上経過したC57BL/6Jマウスを聴覚研究に使用する場合は注意が必要です。特定の実験目的に応じて、他の系統のマウスを使用することができます。
2. 聴覚評価の前に、専門の診断ポケット耳鏡を使用してマウスを検査し、外耳または中耳の病状を除外します。潜在的な徴候には、外耳道の液体や膿、局所組織の発赤や腫れ、鼓膜の穿孔などがあります
   注:これはめったに遭遇しませんが、一度特定されたら、外耳または中耳の病気のマウスは除外する必要があります。

2. 聴力評価

1. 塩酸ケタミン(100 mg / kg)と塩酸キシラジン(10 mg / kg)の混合物の腹腔内注射を使用してマウスに麻酔をかけます。痛みを伴う刺激(例:つま先つまみ反射)で麻酔の深さを判断します。
   注:つま先つま先つまみ反射が完全に欠如している場合、動物は聴覚検査のための麻酔の十分な深さに達しています。両側ABR(聴性脳幹反応)の記録にさらに時間が必要な場合は、麻酔薬の投与量を減らし(元の投与量の5分の1)投与して、元の麻酔面を回復させます。麻酔薬の過剰摂取は、マウスの死につながる可能性があるため、避けるように注意してください。
2. 麻酔をかけた動物の体温を体温調節パッドを使用して37.5°Cに維持します。麻酔をかけた動物を電気的および音響的に遮蔽された部屋に置いて、聴力検査中の干渉を避けてください。
   注:麻酔後の低体温症による死亡を防ぐために、動物が完全に目覚めるまで、全手順で生理学的温度を維持してください。
3. 皮下針電極(20 mm、28 G)を頭蓋骨の頂点(記録電極)、測定した耳の耳介の下の同側耳下腺領域(参照電極)、および反対側耳下腺領域(接地電極)に、それぞれマウスの頭の皮膚下3 mmの深さで配置します。
4. クローズドフィールドスピーカーを使用して、先端が円錐形の2cmのプラスチックチューブを介して音響刺激を行います。先端を外耳道に取り付けます.
   注意: 記録電極と参照電極の電気インピーダンスが3kOhm(通常は1kOhm)未満であることを確認してください。インピーダンスが高い場合は、電極の挿入部位を変更するか、電極をアルコールで洗浄するか、電極を交換してABR波の振幅の変化を避けてください。
5. ABR録音では、トーンピップ(持続時間3ms、立ち上がり/立ち下がり時間1ms、レート21.1/s、周波数:4〜48kHz)を生成し、音圧レベル(SPL)を90dBから10dBに5〜10dBステップで下げて表示します。このステップでは、応答を増幅(10,000回)、フィルタリング(0.1〜3 kHz)、および平均化(1,024サンプル/刺激レベル)します
   注:ABRは、各刺激レベルに対して10dBステップで収集され、しきい値の近くにはさらに5dBステップが収集されます。
6. 各周波数で、最小SPLを指すABRしきい値を決定し、目視検査で明確に識別できる1つ以上の識別可能な波を持つ信頼性の高いABR記録を実現します。
   注意: 通常、波形の一貫性を確保するために、しきい値付近の低SPLに対してプロセスを繰り返す必要があります。応答スレッショルドは、5dBの減少が波形の消失につながる場合に波形を観察できる最低刺激レベルです。

3. 蝸牛組織処理

1. ABR記録後、麻酔をかけたマウスを頸部脱臼で安楽死させ、首を切り落とし、腹側からブラを露出させ、鋭利なハサミで開いて蝸牛にアクセスします。
2. 細い鉗子を使用して、側頭骨を切除し、アブミ骨動脈を切断し、楕円形の窓からアブミ骨を取り除き、丸い窓の膜を破裂させます。針の先端(13 mm、27 G)をゆっくりと回転させて、蝸牛の頂点に小さな穴を開けます。
3. 0.1 M リン酸緩衝生理食塩水 (PBS, pH 7.4) 中の 4% (wt/vol) パラホルムアルデヒドで単離された骨を 4 °C で一晩固定します。先端の細いピペットを使用して、楕円形または丸い窓 (入口として) と頂点の開口部 (出口として) に塗布して、リンパ周囲空間を通して固定剤を静かに洗い流します。
   注:一部のタンパク質は、免疫標識のためのエピトープの破壊を避けるために、短期間の固定を必要とします。このような場合は、免疫組織化学の製造元の指示に応じて、骨を4%パラホルムアルデヒドで室温(RT)で2時間インキュベートします。固定は、特に蝸牛シナプス症のマウスモデルにおいて、後の段階での非特異的染色によるバックグラウンドノイズを回避して、蝸牛血を除去するための心臓灌流によって行うこともできます。
4. 0.1 Mの冷たいPBSで骨を5分間3回すすぎ、残留パラホルムアルデヒドを除去します。10%エチレンジアミン四酢酸(EDTA)で、室温で4時間、または4°Cで24時間、水平シェーカーで20rpmで穏やかに振とうして骨を脱灰します。EDTAは途中で更新できます.
   注:脱灰時間は、EDTAの濃度とユーザーの好みによって異なります。脱灰した組織は、ある程度の靭性を維持する必要があり、これにより、後のステップで蝸牛全体のマウントを分離する操作が容易になります。側頭骨は、回転により10%EDTAで脱灰できるため、研究者はABR試験や固定実験後に研究室を離れることができます。脱灰時間は、4°Cで20〜30時間の範囲で柔軟です。
5. 脱灰した側頭骨1本をEDTAから0.1 M PBSに移します。#3および#5デュモン鉗子と27G針を使用して、頂端、中、基底蝸牛領域を順番に解剖し、次に実体解剖顕微鏡で骨から蝸牛を解剖します。カミソリの刃を使用してらせん状靭帯に沿って一連の小さな切り込みを入れ、構造膜とライスナー膜を取り除きます(図1).
   注:解剖された蝸牛が無傷である限り、このプロセスは個々のオペレーターの通常のプロトコルに従って変更できます。
6. さらに、螺旋輪部を含む残りの聴覚上皮を個々の蝸牛回転(頂点、中央、およびフック領域のある基部)に解剖して、ホールマウントの準備を行います。
7. 光学顕微鏡の40倍オイル対物レンズの下で、接眼レンズに250μmの目盛りを配置して基底膜の長さを測定します。これはIHCの立体繊毛に沿って調整できます。
8. すべてのセグメント長 (セグメントあたり 250 μm) を加算して各蝸牛ターンの長さを計算し、同時に各ターンの長さを合計して基底膜の全長を求めます。
9. フック領域を含む基底膜の全長を、蝸牛の頂点からの距離に基づくパーセンテージに変換します (0% は蝸牛の頂点を指し、100% は蝸牛の基部を指します)。
10. この距離を対数関数 (d(%) = 1 - 156.5 + 82.5 × log(f)) を使用して、周波数の 1.25 mm/オクターブの傾きで、前述のように蝸牛の頂点からの正規化された距離 (パーセント)、f は周波数 (kHz) で、この距離を蝸牛の特性周波数に変換します。したがって、各蝸牛回転における基底膜の対応する領域の周波数範囲を取得することができます。

4. 免疫蛍光染色

1. 解剖後、各蝸牛ターンを別々の2.5 mL遠心チューブに入れ、10%ヤギ血清/PBS/0.1%Triton X-100でローテーター上のRTで1時間インキュベー
トします。
2. 解剖顕微鏡下で200 μLのピペットチップを使用して各チューブから上記のブロッキング/透過化溶液を取り出し、5%ヤギ血清/PBS/0.1%Triton X-100で希釈した一次抗体と試料をローテーターで4°Cで一晩インキュベートします
   注:蝸牛シナプスリボンの免疫標識には、シナプス前マーカーマウス抗カルボキシル末端結合タンパク質2 IgG1(CtBP2、RIBEYE足場タンパク質のBドメインの標識、1:400)およびシナプス後マーカーマウス抗グルタミン酸受容体2 IgG2a(GluR2、α-アミノ-3-ヒドロキシ-5-メチル-4-イソキサゾールプロピオン酸またはAMPA受容体のサブユニットの標識、1:200)を使用します。
3. 0.1 M 冷 PBS で 5 分間 3 回すすぎ、残留一次抗体を除去し、5% ヤギ血清/PBS/0.1% Triton X-100 で希釈した二次抗体と試料を RT で 2-23 時間インキュベートします
   注:ステップ4.2で使用した一次抗体と相補的なヤギ抗マウスAlexa Fluor 568(IgG1、1:500)およびヤギ抗マウスAlexa Fluor 488(IgG2a、1:500)を使用して、適切な二次抗体混合物を調製します。シナプスリボンの標識効率を向上させるために、特定の二次抗体を選択することをお勧めします。一部の研究室では、二次抗体によるインキュベーションを延長して、GluR2免疫標識を強化しています。
4. 0.1 M PBSで5分間3回すすぎ、残留二次抗体を除去し、2.5 mLの遠心チューブから0.1 M PBSを含む35 mmプレートに検体を移します。
5. 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール(DAPI)を含む封入剤をスライド上に一滴垂らし、PBSから封入剤に試料を移します。カバースリップの一方の端をスライドに置き、放してカバースリップを静かに落下させます。
   注:有毛細胞が上を向くようにし、処置中に蝸牛標本の折り畳みやねじれが発生しないように、蝸牛標本を実体解剖顕微鏡の下に取り付けます。
6. スライドを4°Cのスライドボックスに一晩置いて乾燥させ、レーザー共焦点顕微鏡でイメージングします。

5. 蝸牛リボンシナプスの形態学的評価

1. 405 nm UVダイオード、488 nmアルゴンレーザー、561 nmダイオード励起固体(DPSS)レーザーの3つのレーザーを搭載した共焦点顕微鏡を使用した画像スライドで、DAPI(励起スペクトル409〜464 nm)、Alexa Fluor 488(励起スペクトル496〜549 nm)、Alexa Fluor 568(励起スペクトル573〜631 nm)を励起します。 それぞれ。
2. 63 倍の高解像度油浸レンズを使用して、各蝸牛の回転から 8 μm の距離で共焦点 Z スタックを取得します。
   注:定義したら、顕微鏡写真をデジタル化するためのすべてのパラメータを保存し、すべてのスライドに均一に適用する必要があります。
3. シナプス点の数については、zスタック(0.3 μmステップサイズ)を内有毛細胞(IHC)の全長にわたって設定し、すべてのシナプス点を画像化できるようにします。
4. zスタック内のpunctaを含む画像をマージしてz軸投影を取得し、画像処理ソフトウェアにインポートします。
5. 特定の周波数領域における各 z スタックのシナプス合計カウントを IHC の数 (DAPI 核マニュアル カウントに等しい) で除算して、各 IHC のシナプス プンクタの数を計算します。各特定の周波数領域で、9〜11個のIHCを含む異なる微視的フィールドの3つの画像ですべてのシナプス点を平均化します。
   1. フリーハンド選択ボタンを使用して、各IHCの基底外側領域を含む関心領域(ROI)の概要を説明します。プンクタの自動定量化には測定機能を使用し、近接するスポットを区別するには流域機能を使用します。
   2. 各自動カウントの後、手動修正を伴う目視検査を実行して、プンクタカウントの信頼性を確認します。
      注:実験者は、スライドが蝸牛の頂点、中央、または基底回転からのものであるかどうかについて盲検化されたままにする必要があります。
6. シナプスの構造と分布を視覚的に評価し、Pencil Tool(M)を使用して個々のIHCを隣接するIHCから手動で分離し、細胞骨格の構造とシナプスの局在をよりよく視覚化します。
7. シナプス前リボン(CtBP2)とシナプス後受容体パッチ(GluR2)の並置を調べるには、長方形マーキーツールでリボンの周囲のボクセル空間を抽出し、クロップで個々のリボンを分離します。[Image Size] > [Image Size] をクリックして、これらのミニチュア投影のサムネイル配列を取得し、それを使用して、ペアのシナプス (CtBP2 陽性と GluR2 陽性のプンクタの密接に並置されたペアとして表示される) と孤立したリボン (シナプス後グルタミン酸受容体パッチがない) を識別できます (図 2)
   注:正常な蝸牛シナプスは、有毛細胞内のシナプス前リボン(抗CtBP2)と聴覚神経終末のシナプス後グルタミン酸受容体パッチ(抗GluR2)の複合免疫標識として現れます。一部のラボでは、共焦点投影と3Dモデリングを組み合わせて使用し、シナプスパッチのサイズや体積を定量化しています。リボンシナプスが著しく失われる前に、サイズの変化を示すリボン、または対になったグルタミン酸受容体パッチのないリボンは、シナプス機能障害を示している可能性があります。

結果

図1:マウスの蝸牛周波数局在 (A)ステレオ解剖顕微鏡で側頭骨から解剖された、完全外植蝸牛の代表画像。(B)マウスの蝸牛は、蝸牛の側壁が除去されるところで、頂端、中、および基底の回転に分割されます。蝸牛基底膜の断片上の赤い円は、蝸牛の周波数位置とそれに対応する正規化された位置を示しています(0%は蝸牛の頂点を指し、100%は蝸牛の基部を指します)。スケールバー = 250 μm。

図2:

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ケタミン塩酸塩	Gutian Pharmaceutical Co., Ltd., 福建省, 中国	H35020148	100 mg / kg
塩酸キシラジン	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA (米国ミズーリ州セントルイス)	X-1251	10 mg / kg
TDT生理学装置	Tucker-Davis Technologies, アラチュア, FL, USA	聴覚生理システムIII
SigGen/BioSigソフトウェア	Tucker-Davis Technologies, アラチュア, FL, USA	聴覚生理システムIII
電動パッド	ペットの楽しみ	11072931136
デュモン鉗子3#	ファインサイエンスツール、ノースバンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ	0203-3-PO
デュモン鉗子5#	ファインサイエンスツール、ノースバンクーバー、ブリティッシュコロンビア州、カナダ	0209-5-PO
ステレオ解剖顕微鏡	株式会社ニコン(日本、東京)	SMZ1270
ヤギ血清	ZSGB-BIO、北京、中国	ZLI-9021
抗グルタミン酸受容体2、細胞外、クローン6C4	Millipore Corp., ビレリカ, マサチューセッツ州, USA	マブ397	鼠
精製マウス抗CtBP2	BD Biosciences, ビレリカ, マサチューセッツ州, USA	612044	鼠
Alexa Fluor 568ヤギ抗マウスIgG1抗体	Thermo Fisher Scientific Inc., ウォルサム, マサチューセッツ州, USA	A21124 (英語)	山羊
Alexa Fluor 488 ヤギ抗マウス IgG2a 抗体	Thermo Fisher Scientific Inc., ウォルサム, マサチューセッツ州, USA	A21131 (英語)	山羊
DAPIを含む封入剤	ZSGB-BIO、北京、中国	ZLI-9557
共焦点蛍光顕微鏡	Leica Microsystems、ウェッツラー、ドイツ	TCS SP8 II
Image Pro Plusソフトウェア	Media Cybernetics、ベセスダ、メリーランド州、アメリカ	バージョン 6.0
プロフェッショナル診断ポケット耳鏡	Lude Medical Apparatus and Instruments Trade Co., Ltd., 上海, 中国	HS-OT10
針電極	Friendship Medical Electronics Co., Ltd., 西安, 中国	1029	20 mm、28 G
クローズドフィールドスピーカー	Tucker-Davis Technologies, アラチュア, FL, USA	CF1