初期のニワトリ胚の形態形成の組織の変形を追跡

サマリー

この記事では、表面のラベルを説明し、 EX卵組織培養。タイムラプス明視野、蛍光、および光コヒーレンストモグラフィのイメージングへの従順の技術が提示されます。高い時空間分解能で追跡表面のラベルは、2次元および3次元の両方で計算される形態形成株（変形）として運動量を可能にします。

要約

胚上皮は、初期胚の原始的な器官を形成するために複雑な変形を（例えば、ねじり、曲げ折り、そしてストレッチ）を行います。これらの細胞の板の表面上で基準マーカを追跡することはそのような成長、収縮、およびせん断などの形態形成量を見積もるための十分に確立された方法です。しかし、すべての面の標識技術は、従来の画像診断法に迅速に適用可能であり、異なる利点と限界を有していない。ここで、我々は2つ​​の標識方法を説明し、各手法の有用性を示しています。最初の方法では、蛍光ラベル、数百は、磁性鉄粒子を用いて胚に同時に適用されます。これらのラベルは、形態形成時の2次元組織の変形量に使用されます。第二の方法、ポリスチレン微小球で3次元組織の変形を追跡するために非侵襲的光コヒーレンストモグラフィー（OCT）画像で造影剤として使用されています。これらの技術は成功しているLYは、初期の頭の倍、心臓、および脳の発達の物理的メカニズムをstudytheに私たちのラボで実施され、広い範囲の形態形成のプロセスに適応可能でなければなりません。

プロトコル

1。一般的な実験の準備

1. 層流フードの組織培養の培地を準備。
   1. ダルベッコ変法イーグル培地（DMEM）（4.5グラム/ Lグルコース、重炭酸ナトリウム、およびL -グルタミンと1リットルの瓶）を希釈する。 10 mLのペニシリン/ストレプトマイシン/ネオマイシン抗生物質を追加。
   2. 無菌トランスファーピペットでDMEM 100mLのを削除し、ニワトリ血清100mLで置き換えます。
   3. 滅菌済み15 mLコニカルバイアルと凍結に一定分量DMEM/10％ニワトリ血清/ 1％の抗生物質を。
2. カルシウムとマグネシウムを添加したリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を準備します。 100 mLの10X PBS、900mLの脱イオン水、及び濃カルシウムとマグネシウム溶液（100 mg / mLの塩化カルシウム_{2•2H 2} O、100mg/mLのMgCl _{2•6H 2} O）1 mLを混和します。
3. ハンバーガーとハミルトン^1（すなわち、23から25 HHステージ5のための時間、または42で定義されているように、目的のステージに縦向きに卵をインキュベートHHステージ11〜12）は、-48時間。
4. ろ紙キャリア方式を使用して卵から胚を削除します。
   1. A150ミリメートルペトリ皿の側面に卵の底を割れる。下からシェルを離れて引いて、皿に卵の中身を空にします。
   2. 鈍鉗子を使用して、卵からの厚い、粘性のある卵白を削除します。
   3. ワットマン＃2濾紙2〜3センチメートルの円をカット。直径インチろ紙の中央に単穴パンチ、パンチ穴を使用する。リングの中央の穴を通して見える胚を保つ方法で卵黄上にろ紙のいずれかのリングを置きます。
   4. microscissorsとろ紙の外径の周りにカット。細かいピンセットを用い、卵黄から用紙を取り除きます。
   5. ゆっくりと接着卵黄の粒子を除去するためにPBSで胚をすすいでください。 （HH5胚は残存卵黄を除去するために15〜20分限り、浸漬する必要がある場合があります）。お風呂からろ紙のアセンブリを取り外し、それ腹側を上に置く35mmの培養皿。リング間胚を挟んで、最初の頂上番目のフィルタ紙のリングを置きます。胚を保護するために - 濾紙のサンドウィッチ（2 cmの直径≈1.5）の外側の周りに金属リングを置く。
   6. 培地に浸す胚を。明視野顕微鏡との適切な形態と胚の段階を確認してください。
5. その後の組織の解剖と標識のために先端の細いガラス針（1.5内径）（世界の精密機器、サラソタFL）を準備するためにピペットプラーを使用してください。

2。 HHステージのDII標識磁性鉄粒子を用いて5胚

1. 室温で鉄粉の少量（鉄の減少、Mallinckrodtベイカー、（株）、ニュージャージー州フィリップスバーグ）にアルコールで飽和DIIの数滴を追加し、乾燥させる。 （これは通常、アルコールが蒸発した後に一緒にケーキにパーティクルが発生します。）凝集鉄粒子を分割するプルマイクロピペットの先端を使用して、マイクロ遠心チューブに転送し、それらを数回すすぎ、脱イオン水でカバー。
2. HHステージ5胚の外胚葉の細胞を標識するために、培地の寛大な層で覆われた35mmの培養皿で収穫された胚（すなわち、全体のろ紙のアセンブリ）背側を上に置き、解剖顕微鏡下で皿を置く。卵黄膜を除去し、外胚葉の細胞を露出するガラス針を使用してください。 （ピアスの胚ではないに注意してください。）
3. パスツールピペットにラベル付け鉄粒子（脱イオン水で）の列を描画します。解剖顕微鏡、水没だけ胚上記液面との位置の下にピペットチップを使用する。指先との間でゆっくり前後にピペットをローリング、pipietteから粒子をゆすりますと胚全体でそれらを振りかける。
4. 胚の粒子で覆われると、慎重に約10分間37℃のインキュベーターに入れてください。インキュベーターから胚を取り出しD粒子を除去する強力な磁石を使用してください。
5. 図2A、Bに示すように、明視野および胚の蛍光画像の両方を取得するために接続されたビデオカメラと適切なフィルタ設定を使用して蛍光顕微鏡を使用して、
6. ラベルの密度に注意してください。高密度の分布が必要な場合は、再び胚をラベル付けし、それに応じてインキュベーション時間を延長する（上述のように）追加の粒子を使用してください。ラベルがあまりにも密な場合は、すでにラベルの粒子を充填したマイクロ遠心チューブにラベルのない鉄粒子の少量を追加し、チューブの中身を混ぜる。新しい胚とラベリングのプロセスを繰り返し、再度ラベルの密度に注意してください。

3。 HH11 - 12胚の光コヒーレンストモグラフィー（OCT）イメージングのためのポリスチレン微小ラベリング

1. 35ミリメートルのペトリ皿にPBSで黒10μmの直径ミクロスフェア（Polysciences社、ウォリントン、ペンシルバニア州）の溶液を調製します。 （ビーズは、OCTのコントラストを生成するために十分な大きさが必要ですイメージング、しかし十分に小さいビーズの大きさは個々のセルの順になっていることなど。特定の値）をOCTシステムの解像度によって異なりますし、組織が検討されて。 PBSのmL当たり原液の一滴（2.6％固体ラテックス）は、一般的に十分です。 22ゲージの針を使用して10ccのシリンジにこのソリューションを引き出します。均一なビーズ分布を確保するために30秒間ボルテックスソリューション。
2. ベベルコンピュータのハードドライブ^2を使用して、引っ張らガラス針の先端。先端の直径は、ビーズが開口部を通って合うことができる十分な大きさでなければなりませんが、同時に、可能な限り小さく注入時の組織の傷を最小限に抑えます。
3. シリンジを用いてビーズ溶液と傾斜のガラス針を埋める。軽くソリューションは、先端に達したことを保証するためにマイクロピペットをフリック。
4. マイクロマニピュレータを用いて、胚とビューの同じフィールドにガラス針を配置。ビーズは、ピペットの先端部から外れ通過している必要があります。
   1. ないBEAの場合dsはマイクロピペットを終了、詰まりがあるかもしれません。この場合、繰り返しは、新しいガラスの針で3.2から3.4を繰り返します。
   2. あまりにも多くのビーズが視界を曇らせる場合、あなたのピペットチップは広すぎる可能性があります。新しいピペットと新しい胚と手順3.2から3.4を繰り返します。
5. 脳のチューブの内腔にピペットの先端を挿入します。ではない組織の腹床を貫通することを確認してください。ビーズと流体が内腔を入力するときは、組織の一時的な腫れが表示されます。これが成功した挿管を示し、現在、急速にガラスニードルを取り外します。
6. 明視野顕微鏡を用いて脳の管の内腔で十分なビーズの密度を確認してください。セクトに進む前に30分 - ビーズが20のために解決しましょう​​。 4。

4。データ収集

*以下の方法がよく、上記の蛍光標識法に適しています。サンプルを転送するときしかし、ミクロスフェアの標識法と、ビーズが吹き飛ばされることがあるインキュベータとイメージングシステムの間で。このケースでは4.2（これは完全にサンプルの移動/撹拌を避ける）のステップに進むために最善の方法です。液体培地に浸漬しながら両方の方法では、胚を培養している。胚が完全に（いくつかの従来の組織培養技術の場合と同様に）水中ではない場合、組織の形状が大幅に異常に高い表面張力の負荷とひずみ分布によって変更される正確に通常の3 - D形態形成^3、4をキャプチャするために失敗します。また、組織を沈めると、胚の形態およびマーカーの座標を妨げOCT画像の間に気液界面で観測された明るいコントラストを防ぎます。

1. 胚培養（一般）
   1. 最初の画像（明視野、蛍光、またはOCT）を取得した後、150mMのペトリ皿で​​7 35mmの培養皿（胚を含む）まで入れて、小さなビニール袋で全体のアセンブリを配置します。加湿用の袋に脱イオン水の滴をいくつか追加そして95％O ₂ / 5％CO ₂混合物でバッグを埋める。 37℃インキュベーターに胚を置く° C、次の撮影タイムポイントまでの希望時間（キューStabiletherm、アッシュビル、ノースカロライナ州）。この方法を使用して、実験は同じ日に複数の胚で行うことができます。
2. タイムラプス文化（自動）
   1. 培養液1.2 mLを含む、デルタTディッシュ（Bioptechs、バトラー、ペンシルバニア州35ミリメートル、外径、テーパーのサイドウォール、0.17ミリメートル厚のガラスと23ミリメートルの中央開口部）にラベルされた胚を置きます。
   2. ° C BioptechsデルタT4培養皿のコントローラを（結露を防ぐために）使用して37℃に保たガラス蓋付き皿に蓋をする。ミニポンプ可変流量デバイス（フィッシャーサイエンティフィック）から供給される95％O ₂ / 5％CO ₂ガスの混合物で胚を表面かん流する。前の胚、熱に達すると暖かい（<100℃）、ホットプレート上で脱イオン水を介してそれをバブリングすることによりガスを加湿する。この実験的なsの概略図ETアップを図1に示されています。
   3. 自動的にユーザーが指定した時間間隔で画像を取得するためにソフトウェアを設定します。私たちの蛍光顕微鏡の場合、我々は（パーキンエルマー、ウォルサム、マサチューセッツ州）オープンラボソフトウェアを使用して、そして私たちのOCTシステムのために、我々は掃引源Thorlabsソフトウェア（ニュートン、NJ）を使用してください。このメソッドは現在のところに一つタイムラプス実験を扱うことができるだけなので時間は、それは文化のこれらのタイプは、夜間に実行できるようにするのが最善の方法です。一つは、イメージングシステム⁵のハードウェアとソフトウェアの両方と互換性のある自動翻訳の段階をインストールすることにより、この制限を回避可能性があります。

5。代表的な結果：

ラベルは、各実験で自動的に追跡（Volocityを使用して、パーキンエルマー社）または手動（ImageJので手動トラッキングプラグインを使用して、NIH）されています。蛍光標識法では、我々は可能なマーカーの座標、を介して2Dサーフェスに合わせてMatlabのルーチンのgridfitを使用してください形態形成の表面の株は^6,7を算出する。標準的な方程式は、関連する胚の座標系にこれらの値を変換するために使用されています。また、OCTの技術で、表面はセグメント化された画像のボリュームから生成されます（このようなMatlabやキャレット⁸など標準的なソフトウェアを介して取得）と株は、試料⁹の最大値または最小曲率の方向に計算することができます。

我々は初期のニワトリ胚の頭部倍形成中胚葉細胞の動きにラベルを付けたり、追跡するために私達の鉄の粒子の技術を使用していました。図2Aに示すように、蛍光標識した細胞は、全体の胚全体に分布していた。明視野と胚の蛍光画像は 、ex 卵培養中に異なる間隔で捕獲された。追跡されたラベル（図2B、C）の動きは、その後、ヘッド倍に形成した（図2D - F）の間に進化して形態形成のひずみ分布を計算するために使用されていました。

tは">同様に、私たちのポリスチレンマイクロスフェア技術は初期のニワトリ脳の半ばに後脳境界で組織の動きを追跡するために使用された。図3 BDに示すように、ビーズの動きは、縦とで組織の変形を特徴づける6時間と株のために追跡された円周方向は、マーカーの座標から計算した。この方法は、ビーズのようなはっきりと3 - D変形を扱うことができることに注意して脳の内腔（図3A）のすべての辺に固執する傾向がある。

図1。タイムラプス組織培養のためのセットアップの概略図。

図2。追跡蛍光ラベルを使用して初期のニワトリ胚での2次元組織の変形を定量化。 （）鉄の粒子を除去した後の明視野/ HHステージ5胚の蛍光像を合併。 DII -ラベルED外胚葉細胞（赤色）が全体の胚全体に分散されます。 （B、C）標識細胞の動きは、ImageJを用いて追跡した。ラベルの変位は、胚の座標（X、Y）で計算した。 AとBが同じ画像であることに注意してください。 （DF）ヘッド倍形成の間に長手方向のひずみ分布を進化の等高線プロット。長手方向のラグランジュ株は、（D）75分、（E）120分、およびインキュベーションの（F）165分後にHHステージ5（すなわち、AとB）と比較して計算された。これらの菌株はY軸（ステージ5胚で）に沿って元々指向の線要素の長さの変化を特徴付ける。追跡ラベルを使用すると、形態形成の菌株を計算する座標の詳細については、Filas ら ^{（2007）6、Varner} ら ^（2010）7で見つけることができます。 CとFが同じ画像であることに注意してください。スケールバー= 500μmの。

図3 3次元組織Dの定量初期のニワトリ脳内eformations。背側に付着（黒矢印）と脳の管の腹側（白い矢印）の側面は、OCTの再建の横断section.Ventralビューで周辺組織から容易に識別できるものは半ば後脳境界付近の微小球の位置を示す（A）ポリスチレン微小球（B）HH12時と後に（C）インキュベーションの6時間（M：中脳、H：後脳）。ビーズのいくつかのグループが組織の全体的な変形を強調するために概説されています。 （D）縦（E _ZZ）と円周は_（Eθθ）ラグランジュの菌株は、これらの変形から計算した。半ば後脳の境界で正の縦と負の周方向の株が培養中にこの地域の延長軸方向と円周方向の短縮を反映している。形態形成の間に複雑な表面のために形態形成の系統の計算に関する詳細は、Filas ら ^（2008）9で見つけることができます。スケールバー= 200μmの。

ディスカッション

二つの組織の標識技術は、初期のニワトリ胚の元OVO文化のために表示されている。最初は同時に細胞の数百をラベル付けする磁性鉄微粒子を介して配信蛍光親油性色素を使用しています。蛍光染料は一般的に^{10月10日を}使って周囲の組織から少しコントラストを示すようにしかし、この方法は、現在、光コヒーレンストモグラフィーと互換性がありません。したがって、我々は、タイムラプスのOCT解析のための組織を標識するためにポリスチレン微小球を使用して別の方法を示しています。この手法は3次元のデータセットが得られますが、注意は、組織からビーズが剥がれないよう注意する必要があります。適切な実験設定でこれらのメソッドのいずれかを使用すると、初期胚における信頼性の高い組織のラベリングとEX OVO開発を提供する必要があります。どちらの方法もすぐに利用できる、比較的低コストの材料（例えば、鉄粉、ポリスチレン微小球）を使用し、形態形成の間に定量化する組織の変形を有効にします。市販どちらの場合も組織のマーカーを簡単にかつ再現性胚組織に適用することができ、フィールドでの新規参入者にこれらの実験にアクセスできるよう、特殊な...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
材料/試薬	会社	カタログ番号	コメント
DMEM - 高グルコース	シグマアルドリッチ	D5796
ペニシリン/ストレプトマイシン/ネオマイシン	シグマアルドリッチ	P4083
鶏血清	インビトロジェン	16110-082
ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水	シグマアルドリッチ	D1408	10X
ワットマン＃2濾紙	ワットマン紙	1002 090	90ミリメートルの直径
ガラスのマイクロピペット	世界の精密楽器（WPI）	TW150 - 6	1.5ミリメートル、内径
DII	インビトロジェン	D - 282
鉄の減少	Mallinckrodtベイカー（株）	5320
10μmの直径ミクロスフェア（黒）	Polysciences株式会社	24294
デルタTディッシュ（タイムラプス培養用）	Bioptechs	04200415B	黒、厚さ0.17ミリメートル
デルタT4培養皿コントローラ	Bioptechs	0420-4-03
ミニポンプ可変流量デバイス	フィッシャーサイエンティフィック