共培養におけるグルタミン酸作動性ニューロンと神経膠腫細胞の相互作用の評価

要約

出典: Fuchs, Q. et al., Co-culture of Glutamatergic Neurons and Pediatric High-Grade Glioma Cells into Microfluidic Devices to Assess Electrical Interactions. J. Vis. Exp. (2021)

このビデオは、多電極アレイを備えたマイクロ流体デバイスを使用して、hiPSC由来の皮質グルタミン酸作動性ニューロンと神経膠腫細胞の共培養におけるニューロンの電気的活動の評価を示しています。

プロトコル

>サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. 共培養プロトコル

1. UW479およびBT35細胞株の播種日と濃度を調整して、共培養を開始するときにコンフルエント細胞の80%に達するようにします。これは、グルタミン酸作動性ニューロンの培養の21日間に相当します。
2. UW479およびBT35細胞をトリプシン化し、各専用マイクロ流体デバイス(各細胞タイプで目標密度900細胞/mm²)のグルタミン酸作動性ニューロンの上部に播種してから、小児高悪性度神経膠腫(pHGG)細胞を成熟したグルタミン酸作動性ニューロンを含むマイクロ流体デバイスに播種します。
3. 制御された環境(37°C、5%CO₂)で、グルタミン酸作動性ニューロンDay11および表1に詳述されている培地以降を使用して、共培養物を2日間維持します。
4. 画像解析ソフトウェアで解析した顕微鏡画像を用いてpHGG細胞をカウントし、その生存率を評価します。セルの割合を計算します.
   注:次の式を使用します:100 - ((D23のセル数/D21のセル数)x 100)。

2. 電気生理学的記録

1. 電気生理学的記録は、商用システムと市販のソフトウェアで行います.
   手記：実験は、直径30μmの電極を100μm間隔で配置した多電極アレイ(MEA)を用いて行いました。
2. pHGG細胞の播種前に、D21のグルタミン酸作動性ニューロンで最初の電気生理学的記録を行います。分化したグルタミン酸作動性ニューロンをコントロールとして使用し、共培養と並行してそれらを単独で培養します。次の手順 3 で説明するように、両方の条件に対して 2 回目の録音を行います。
3. D23で2回目の電気生理学的記録を行います(2日間の共培養後)。

>表1:hiPS由来グルタミン酸作動性ニューロンの培地組成物。

ム

コンポーネント	播種培地	D4ミディアム	D7ミディアム	D11 およびそれ以降の媒体
DMEM/F-12ミディアム	0.5倍	0.25倍	0.125倍	Ø
ニューロベースルミディアム	0.5倍	0.25倍	0.125倍	Ø
BrainPhysミディア	Ø	0.5倍	0.75倍	1倍
SM1サプリメント	1倍	1倍	1倍	1倍
N2サプリメント-A	1倍	1倍	1倍	1倍
Ala-GLN (GlutaMax)	0.5 mM	0.5 mM	0.5 mM	0.5 mM
BDNFの	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL
GDNFの	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL	10 ng/mL
TGF-β1	1 ng/mL	1 ng/mL	1 ng/mL	1 ng/mL
ゲルトレックス	30 μg/mL	Ø	Ø	Ø
播種サプリメント	1倍	Ø	Ø	Ø
4日目 補足	Ø	1倍	Ø	Ø

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
256MEA100/30iR-ITO-オー付	MCSの	256MEA100/30iR-ITO-オー付
セプターカウンター用40μmプローブ	ダッチャー	53750
セプターカウンター用60μmプローブ	ダッチャー	51999
Ala -Gln (GlutaMAX)	シグマ	G8541
クラスII生物学的安全キャビネット	サーモサイエンティフィック	HERAセーフェタイプKS12
皮質グルタミン酸作動性ニューロン	ブレインゼル	品番:BX-0300
DMEM/F12 ミディアム	シグマ	D8437
DPBSの1X	ダッチャー	L0615-500
EasYFlaskTM細胞培養フラスコ75cm3	ヌンク	156499
ウシ胎児血清(FBS)	ダッチャー	500105
GDNFの	ペプロテック	450から10
ゲルトレックス	ライフテクノロジー	A1413201
ヒトBDNF	ペプロテック	450から02
孵卵器	メメルト	IC0150メド
MEA2100	MCSの	181205-MEA2100-11240
マイクロピペット P10	ザルトリウス	LH-729020
マイクロピペット P100	ザルトリウス	LH-729050
マイクロピペット P1000	ザルトリウス	LH-729070
マイクロピペット P200	ザルトリウス	LH-729060
マイクロチューブ エッペンドルフ 1.5 ml セーフロック	ダッチャー	33290
マルチチャンネル実験ツール	MCSの	-
N2サプリメント-A	ステムセル	7152
ニューロベースルミディアム	ライフテクノロジー	21103049
Neurocult SM1 ニューロンサプリメント	ステムセル	5711
L-グルタミンを含まない非必須アミノ酸(NEAA)	ダッチャー	X0557-100
ピペトゥール ピペットエイド XP グラビティ	ドラモンド	4000202/4038202
細胞培養用ピペット 10mL Falcon®	ダッチャー	357551
細胞培養用ピペット 5mL Falcon®	ダッチャー	357543
プラーク・ショーファンテ(CultureTemp)	ベラール	370151000
ポリ-D-リジン	シグマ	P6407
プリモバート顕微鏡	ツァイス	415510-1100-000

年 の 名 型