電極アレイと光ファイバーのマウス海馬への埋め込み

Abstract

出典:Bender, F., et al., Optogenetic Entrainment of Hippocampal Theta Oscillations in Behaving Mice. J. Vis. Exp. (2018年)

このビデオは、マウスモデルの海馬にワイヤー電極アレイと光ファイバーを定位的に移植する様子を示しています。

Protocol

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 光ファイバーの準備 (図 1A)

1. マルチモード光ファイバー(105μmコア、シリカコアガラス被覆、0.22NA)を使用します。ファイバーがファイバースプールに取り付けられたままの状態で、マイクロストリッパーを使用してファイバーコアの125μmクラッドを剥がします。
2. ダイヤモンドナイフを使用して繊維を約2〜3cmの長さにカットします。
3. ジルコニアセラミックスティックフェルール(内径:126μm)にファイバーを挿入します。光ファイバーの約0.5〜1mmがフェルールの凸面から突き出ている必要があります。
4. 針を使用して、フェルールの両端にエポキシ接着剤を1滴塗布しますが、フェルールの側面には塗布しません。または、瞬間接着剤を使用します。
5. 接着剤を少なくとも30分間乾かします。
6. フェルールの凸面をダイヤモンドラッピングファイバー研磨フィルム(3μmグリット)で研磨します。
7. 光パワーメーターを使用して、光伝送の忠実度をテストします。
   1. パワーメーターの波長は、使用しているレーザーと同じ波長に設定します。
   2. パッチコードは、先端がセンサーの中央を向くように配置します。レーザーの電源を入れ、パワーメーターからの光出力を読み取ります。値を記録します。
   3. 光ファイバーを嵌合スリーブを介してパッチコードに接続し、ファイバーの先端をセンサーの中心に向けて配置します。レーザーの電源を入れ、パワーメーターからの光出力を読み取ります。値を記録します。
   4. 2 番目の値を最初の値で割って、伝送速度を計算します。伝送速度が0.5未満の場合は、ファイバーを廃棄します。それ以外の場合は、移植に使用します。
   5. 移植前に各ファイバーの透過率をテストします。
   6. 後の実験では、レーザーの光強度出力を光ファイバーの伝送速度に調整します:パッチコードの先端からの光出力を5〜15を透過率で割った値に設定して、ファイバー先端からの最終的な光出力を5〜15mWにします。

2. LFP記録用のタングステンワイヤアレイの準備(図1B)

1. テープの粘着面に平行に、数個(たとえば6個)の100μmシリカチューブガイドを接着します。1つのワイヤーアレイアセンブリ用に、約4〜6mmの1ピースをカットします。
2. 鉗子を使用してガイドチューブにフォームバー絶縁された45μmのタングステンワイヤーを通します。
3. エナメル絶縁された細い銅ボンディングワイヤー6本(長さ約5 mm)とアース線(長さ約2〜3 cm)をメスで剥がして両端の絶縁体を剥がします。ナノコネクタピンにはんだ付けします。
4. 各ボンディングワイヤを1本のタングステンワイヤにそれぞれ1滴の銀導電性塗料で接続します。少なくとも30分間乾燥させます。
5. ワイヤーを覆うために最小限のセメントを塗布します。脳組織に挿入されるタングステンワイヤーやナノコネクタの上部にセメントを塗布しないでください。セメントを少なくとも30分間乾かします。
6. 鈍いステンレス鋼のはさみを使用してタングステンワイヤーの角度カット(5-20°)を実行し、シータ振幅が狭すぎて巻き込みの忠実度を推定できない地層ピラミッドに隣接するゾーンの下または上にワイヤーを確実に移植できるようにします。
7. アース線の先端(約2mm)をメスで削り取り、絶縁体を剥がします。フラックスと予備はんだ付けで処理します。
8. デジタルマルチメータを使用して電極間の潜在的なクロストークを確認します。コネクタピンをマルチメータに接続し、マルチメータを抵抗測定モードに設定する必要があります。チャネルのペアワイズの組み合わせを確認します。マルチメータの読み取り値が5MΩ未満の場合、クロストークが大きいことを示します。
9. インピーダンスメーターを使用して、生理食塩水中の各ワイヤ電極のインピーダンスを確認します。標準的なインピーダンス値は100kΩ未満です。
10. 移植を容易にするために、1本の光ファイバーをワイヤーアレイに接着して、ファイバーの先端が最も短いワイヤーの高さになり、ファイバーの先端がタングステンワイヤーに接触しないようにします。移植時の組織損傷を防ぐために、繊維の角度はできるだけ小さくしてください。

3. 脳定位固定

装置移植

1. 頭蓋骨の上部から結合組織を取り出し、記録中の筋肉のアーチファクトを防ぐために、首の筋肉を約2mm完全に押し下げます。
綿チップの
2. アプリケーターと生理食塩水を使用して頭蓋骨を清掃し、4つの穴(前面に2つ、小脳の上に2つ、直径0.8 mm)を開けて、インプラントの接地と安定化のために骨ステンレス鋼ネジ(00-96x1 / 16)を配置します(図1D)。アースネジを小脳の上の1本の銅線(長さ約2〜3 cm)に接続された位置に配置します。
3. 電気生理学的記録中の筋肉のアーチファクトを防ぐために、アーススクリューをセメントで完全に覆います。すべてのネジを接続するセメントリングを組み立てます(図1E)。
4. 移植側の上で開頭術を行います (海馬、AP -1.94、L 1.4、ブレグマを基準にした V 1.4)。約5 μLの滅菌NaClを脳組織の表面に塗布します。
5. 開頭術でステレオタクシーを使用してワイヤーアレイをゆっくりと下げます。ユニタリー記録の場合は、ワイヤーアレイの代わりにシリコンプローブを埋め込みます。光電光アーチファクトを防ぐために、光ファイバーの先端がプローブに直接向かないように、光ファイバーを海馬に別々に埋め込みます(図1C-I)。半球間の巻き込みの調整を調査するために、反対側の海馬CA1領域に追加の光ファイバーを埋め込みます。
6. 脳組織を保護するために、70°Cに予熱した約5μLの温かい液体ワックス/パラフィンオイルを、移植部位の上にシリンジで塗布します。
7. ワイヤーアレイの周囲にセメントを塗布し、頭蓋骨をセメントで覆います。
8. はんだ付け済みのアース/基準線と、アースネジに接続されたはんだ付け済みのワイヤに1滴のフラックスを塗布します。これは、例:ample、針、はんだ付け機を使用してワイヤを溶断します。
9. アース線全体をセメントで覆います。
10. 0.3 mLのエリシナム(滅菌NaClで1:4)とカルプロフェン(5mg / mL)を静脈内投与します。手術後および手術後少なくとも2日間。.マウスは通常、手術後15分以内に目覚めます。赤いランプで動物を温めて、回復を早めます。
11. 手術後の最初の1週間、またはマウスが安定するまで、マウスの体重を毎日監視します。体重減少は、手術前にマウスが記録した体重の10%を超えてはなりません。体重の安定化を加速するために、手術後の最初の数日間はマウスにウェットフードとコンデンスミルクを与えます。
12. 同調中の海馬細胞活動を記録するには、海馬にシリコンプローブを埋め込みます(AP -1.94、L 1.4、V 1、その後下降)(図1C-I)。AP -3、L 1.4、V 1.6、39°尾側吻側の海馬に光ファイバーを埋め込みます。細胞体型の刺激が必要な場合は、MSに追加の光ファイバーを埋め込みます(AP +0.98、L 1、V 3.9、15°横方向)。

Results

図1:光ファイバー、電極、手術の図。(A)光ファイバーのイラスト。(B)海馬シータ振動の巻き込み中に海馬LFPを記録するために光ファイバーに接着されたワイヤーアレイの図。(C)海馬の細胞活動を記録するために、マイクロドライブにシリコンプローブを装着します。(D)ミニチュアネジが頭蓋骨に配置されています。銅線は、小脳の上に配置する前に、アースと基準ネジに事前にはんだ付けされています。(E)ネジを覆って接続するためにセメントが塗布されます。上部の青い円は、シリコンプローブの埋め込みのために開頭術が行われた場所を示しています。下の青い円は、海馬に光ファイバーを埋め込むために開頭術が行われた場所を示しています。(F

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
PV-Creマウス	ジャクソン研究所	B6;129P2-PVALBTMM1(cre)アーブラ/J
ステレオタクシー	David Kopf Instruments、米国カリフォルニア州トゥジュンガ	モデル 963	超精密な小動物用定位固定装置です
ドリル・ビット、0.8 mm	Bijoutil, Allschwil, スイス	49080HM
はんだ付けステーション	Weller Tools GmbH、ベジッヒハイム、ドイツ	WSDの81
エリスロマイシン	Rotexmedica GmbH、トリッタウ、ドイツ	PZN:10823932	輸液用粉末 1g
精密ドリル/グラインダー	Proxxon、Wecker、ルクセンブルク	FBS 240/E
マルチモード光ファイバー	ThorLabs、ダッハウ、ドイツ	FG105LCA	0.22 NA, Low-OH, Ø105 μm コア, 400 - 2400 nm
セラミックスティックフェルール	精密繊維製品、ミルピタス、カリフォルニア州、米国	CFLC126	セラミックLC MMフェルール、ID 126um
紙の研磨	ソーラブ	LF3Dの	6 "x 6"ダイヤモンドラッピング(研磨)シート
パワーメーター	ソーラブ	PM100Dの	コンパクトな電力およびエネルギーメーターコンソール、デジタル4インチLCD
マルチモード光ファイバーカプラー	ソーラブ	FCMM50-50A-FC	1x2 MMカプラー、分割比50:50、50μmGIファイバー、FC/PC
光ファイバーパッチコード	ソーラブ	FG105LCAカスタムMUC	カスタムメイド、長さ3 m、保護チューブ付き、チューブ:FT030、コネクタ1:FC / PC、コネクタ2:1.25mm(LC)セラミックフェルール
袖	精密繊維製品、ミルピタス、カリフォルニア州、米国	ADAL1	Ø1.25mm(LC / PC)フェルール用のセラミックスプリット嵌合スリーブ
タングステンワイヤー	California Fine Wire Company, グローバービーチ, CA, USA	CFW0010954	40μm、99.95%
キャピラリーチューブ	オプトロニクス	1068150020	内径:100.4μm
オムネティクスナノコネクタ	Omnetics Connector Corporation、米国ミネアポリス	A79038-001 (日本語)
ネジ	ビラニー、デュッセルドルフ、ドイツ	00-96x1/16	ステンレススチール製
シルバー導電性塗料	Conrad electronics、ドイツ	530042
液体フラックス	Felder GMBH Löttechnik, オーバーハウゼン, ドイツ	ロトルST	DIN EN 29454.1、3.2.2.A(F-SW 11)