海馬ネットワークダイナミクスの光遺伝学的制御

要約

出典:Manseau, F., et al.Tuning in the Hippocampal Theta Band In Vitro: Methodologies for Recording from the Isolated Rodent Septohippocampal Circuit.J. Vis. Exp.(2017年)

このビデオでは、マウスの脳スライスで遺伝子組み換えされた光感受性介在ニューロンを活性化し、シータ振動の同期を強化し、神経回路の振る舞いを研究することにより、光遺伝学を使用して海馬ネットワークのダイナミクスを調節する方法を示します。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 孤立した海馬の光遺伝学的制御
   注:海馬ネットワーク活動の光遺伝学的制御のために、PV(パルブアルブミン陽性)含有GABA作動性細胞のリズミカルな活性化を含む細胞型特異的戦略がここで使用されますこれらの細胞は、単離された海馬の主要な細胞集団を同期する上で主要な役割を果たすことが示されました。PV細胞における興奮性チャネルロドプシン-2(ChR2)の選択的発現は、PV-Creマウス系統とChR2 Cre依存性を構成的に発現するマウス(Ai32)を交配することにより達成され、PV-ChYマウスを作製します。あるいは、ウイルスベクターコンストラクト(AAVdj-ChETA-eYFPなど)をPV-CreまたはPV-TOMマウス(P15-16)の海馬に注入して、CA1/SUB介在ニューロンにおける興奮性オプシンの発現を駆動することもできます(図1A)。
   1. CA1/SUB(Cornu ammonis-1/subiculum)領域にLFP電極を配置し、PV介在ニューロンの青色光感受性興奮性オプシンChR2を発現するマウスの単離海馬の近くの錐体細胞にパッチを当てます。
   2. 光ファイバーライトガイド(直径0.2〜1 mm)を海馬製剤の上に置き、記録された領域の中央に配置します。光パルス(トランジスタ-トランジスタロジック信号によってトリガーされる10〜20ミリ秒)またはシータ周波数(4〜12Hz)で配信される正弦波電圧コマンドで構成される光遺伝学的刺激用のLED光源からの青色光(473nm)を使用します。
   3. 電流クランプに切り替えて、自発的なシータ振動中のピラミッド型の活動を特徴付けます。
   4. 刺激プロトコルを開始し、光の反応を記録します。記録されたニューロンの電界振動とシナプス活動は、光遺伝学的刺激中にますます同期し、PV細胞のリズミカルなペーシングがシータ振動の周波数とパワーの両方を堅牢に制御することがわかります(図1)。

結果

図1:孤立した海馬における自発的および光遺伝学的に駆動されるシータ振動中の単一のCA1/SUB錐体ニューロンおよびPVニューロンからの局所電界電位および同時パッチクランプ記録。

(a) 青色光感受性オプシン (ChETA と蛍光色素 eYFP 結合) を発現する CA1/SUB 領域の上に光ファイバーガイドを配置した LFP およびパッチ電極の記録部位を示す図。(b)記録された細胞の典型的な規則的スパイキング(RS)特性(上)と高倍率(40倍)画像(下)を示す錐体ニューロンの特性評価。(c)同じ細胞の脱分極膜電位(黒)とLFP信号(灰色)で、自発振動中(左)とシータ周波数(6Hz)光刺激中(右)の同期したリズミカルIPSPを示すサンプル電流...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
試薬
塩化ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S9625
蔗糖	シグマ・アルドリッチ	S9378
炭酸水素ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	S5761
NaH2PO4 - リン酸ナトリウム一塩基性	シグマ・アルドリッチ	S8282
硫酸マグネシウム	シグマ・アルドリッチ	M7506
塩化カリウム	シグマ・アルドリッチ	P3911
D-(+)-グルコース	シグマ・アルドリッチ	G7528
塩化カルシウム二水和物	シグマ・アルドリッチ	C5080
アスコルビン酸ナトリウム	シグマ・アルドリッチ	A7631-25Gの
備品
95%O2/5%CO2混合ガス(カルボゲン)	ヴィタレア	SG466204A	灌流システム
ガラス瓶/フラスコ(4 x 1 L)	N.A.	N.A.	灌流システム
水中記録室	カスタムデザイン(FM)	N.A.	商用の代替手段を使用できます
マルチクランプ700Bパッチクランプアンプ	分子デバイス	マルチクランプ	電気 生理 学
マルチクランプ700Bコマンダープログラム	分子デバイス	マルチクランプ	電気 生理 学
デジタル/アナログコンバーター	分子デバイス	DDI440	電気 生理 学
マイクロマニピュレーター(手動操作)	シスキユー	MX130	電気生理学(LFP)
マイクロマニピュレータ(自動)	シスキユー	MC1000Eの	電気生理学(パッチ)
オーディオモニター	A-Mシステムズ	モデル3300	電気 生理 学
カスタムメイドの正立蛍光顕微鏡	シスキユー	N.A.	イメージング
アナログビデオカメラ	コフー	4912-2000/0000	イメージング
イメージングソフトウェアを備えたデジタルフレームグラバー	株式会社エピックス	ピクシー-SV7	イメージング
オリンパス2.5x対物レンズ	オリンポス	MPLFLN	イメージング
オリンパスの40倍水浸対物レンズ	オリンポス	UIS2 ルンプルフン	イメージング
カスタムメイドの発光ダイオード(LED)システム	習慣	N.A.	光遺伝学的刺激 (Amhilon et al., 2015)
動物
PV::Cre (KI) マウス	ジャクソン研究所	品番 008069	PV介在ニューロンにおけるCre指向性遺伝子発現を可能にする
Constitutive-conditional Ai9マウス (R26-lox-stop-lox-tdTomato (KI))	ジャクソン研究所	品番 007905	Express TdTomatoはCre-mediated recombinationに続く
Ai32マウス(R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP	ジャクソン研究所	品番 012569	Creリコンビナーゼへの曝露後に改善されたチャネルロドプシン-2/EYFP融合タンパク質を発現
PVChYマウス	ハウスブリーディング	N.A.	PV-Cre系統とAi32マウス(R26-lox-stop-lox-ChR2(H134R)-EYFP

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