同時光刺激とビデオ録画による機能的神経筋接合部の評価

要約

出典: Liberman, M., et al., Engineering and Characterization of an Optogenetic Model of the Human Neuromuscular Junction. J. Vis. Exp. (2022年)。

このビデオでは、機能的な神経筋接合部を評価する方法を示します。筋肉組織と運動ニューロンを含むバイオリアクターと蛍光顕微鏡法を用いて、ニューロン内の光感受性チャネルを刺激して電気信号を生成し、筋線維の収縮を引き起こします。

プロトコル

サンプル採取を含むすべての手順は、研究所のIRBガイドラインに従って実行されています。

1. バイオリアクターの準備

1. バイオリアクター金型を作る
   1. 補助CADファイルからバイオリアクターCAD(Computer-aided design)ファイルをダウンロードするか、カスタム設計を作成します。
   2. CAM(Computer-aided Manufacturing)ソフトウェアを使用して、3DモデルからCNC(Computer Numerical Control)ツールパスを生成します。
   3. CNCフライス盤を使用してアセタール金型を加工します。
2. バイオリアクターの作製
   1. ポリジメチルシロキサンの硬化剤混合物に10:1塩基を混合します(PDMS、4つのプラットフォーム/金型あたり77 gの混合物)。
   2. 混合物を真空チャンバーに入れ、すべてのバルブを閉じ、真空をオンにし、気泡がなくなるまで混合物を少なくとも30分間ガス抜きします。混合物を型に流し込み、真空チャンバー内で型を1時間脱気します。
   3. 金型の上半分が正しい向きになるように金型を閉じます。スチール製の六角形のロッドを中央に置き、両側をクランプします。
   4. 上部にPDMSを補充します。
   5. 型を65°Cのオーブンで少なくとも4時間硬化させます。
   6. 室温まで冷却した後、プラットフォームを金型から取り外します。
   7. 1時間サイクルの食器用洗剤、400mLの100%イソプロパノール、および蒸留水を使用して、超音波浴でデバイスを洗浄します。
   8. 65°Cで一晩乾燥させます。
   9. ガラスカバースリップを1%非イオン性界面活性剤ポリオールに30分間浸し、積み重ならないようにして、すべてが適切にコーティングされるようにします。
   10. 蒸留水でよくすすぎ、65°Cで一晩乾燥させます。
   11. ガラスカバースリップとPDMSプラットフォームを、6 L /分の酸素を1〜2分間充填したプラズマクリーナーで処理します。処理後、PDMSをカバーガラスに少なくとも30秒間押し下げて、2つを結合します。
   12. 細胞を追加する前に、結合したデバイスをオートクレーブします。

2. 光刺激のセットアップの構築

1. 30 mmケージキューブシステムを使用して、中央に573 nmダイクロイックミラーを取り付けます。赤色の627nmLED(発光ダイオード)と594nmのロングパス励起フィルターを結合し、LEDをミラーに向けてキューブの上面に取り付けます。次に、図1Aの回路図に示すように、LEDをミラーに向けて、546nmのショートパス励起フィルタを備えた青色の488nmLEDをキューブの隣接する側に取り付けます。
2. リング作動式の虹彩ダイアフラムをケージキューブの底に取り付けて、照らされる領域のサイズを制御します。
3. T-Cube LEDドライバーで各LEDに電力を供給し、Arduino Uno Rev3ボードを介して制御します。LEDドライバーのサイド入力を電源プラグに接続し、中央の出力をArduinoに接続し、サイド出力を直接LEDに接続します。
4. Arduino UnoをUSBケーブルでコンピューターに接続します。
5. GitHub のリンク (https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis) からファイルをダウンロードします。
6. GitHubフォルダから「Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino」ファイルを開きます。
7. 開始パラメータを設定します。Steps = 30; startFrequency = 0.5; endFrequency = 3; pulseLength = 100。
8. ピン出力 4 が青色 LED ドライバーに割り当てられ、ピン出力 2 が赤色 LED ドライバーに割り当てられていることを確認します。LEDドライバーの中央のワイヤーがアースとそれぞれのピン出力に接続されていることを確認します。
9. 「Optical_Stimulation_Ramp_Arduino.ino」プログラムをコンパイルしてArduinoにロードします。
10. 各LEDドライバーを対応するチャネルに接続します。

>3. 細胞培養のセットアップ (-21-0 日目)

1. 初代骨格筋細胞
   1. 一次骨格筋芽細胞(Cook Myositeから取得)を解凍して拡大し、筋強壮増殖培地(+サプリメント)を使用して最大6つの継代を行います。細胞を37°Cおよび5%CO₂に設定したインキュベーターに保持します。
   2. メディアは2日ごとに交換してください。
   3. 細胞が約60%コンフルエントになったら、0.05%トリプシン-EDTA(1x、37°Cで5分間)を使用して細胞を通過させます。解離した細胞を採取し、トリプシンを中和するために新しい培地を加えます。
   4. 細胞を300 x gでスピンダウンし、上清を細胞ペレットの上に吸引します。
   5. MGMで細胞を再懸濁し、3層フラスコあたり60mLで1:3に播種します。
2. ChR2-hiPSC
   手記：この研究のためのすべての細胞株は、米国ニューヨーク州コロンビア大学の機関ガイドラインに準拠して作成および使用されました。このプロトコルでは、ChR2発現hiPSCをCRISPR-Cas9ゲノム編集により、前述の方法18を用いて作製したが、任意の安定した光遺伝細胞株(lentiviral、piggyBacなど)も同様に使用することができる。iPS細胞と運動ニューロンの両方で発現する構成的プロモーターが選択されました(CAG)。これらの細胞は、以前の論文で述べられているように、健康な核型を有することがわかった。
   1. DMEM/F12(1:80)で希釈した可溶化基底膜マトリックス1 mL/ウェルで6ウェルプレートをコーティングし、プレートを室温で1時間インキュベートします。
   2. コーティングされた6ウェルプレートに2 mLのフィーダーフリー細胞培養培地(iPSC培地)を播種し、2 mLの培地を隔日で交換し、5〜7日ごとに継代します。細胞を37°Cおよび5%CO₂に設定したインキュベーターに保持します。
   3. パッセージ
      1. 幹細胞を1 mLの酵素フリー幹細胞放出試薬と4分間インキュベートし、先端のワイドチップP1000ピペットで機械的にせん断することにより、幹細胞を解離します。
      2. コーティングされた6ウェルプレート上に、2 μMのY-27632二塩酸塩を2 mL/ウェルで含有させたiPS細胞培地中で、1:24または1:48の比率で細胞を播種します。

4. 骨格筋組織の播種 (-3日目)

1. 自動セルカウンターを使用して、30 x 106筋芽球を分離し、カウントします。
2. 3 mg/mL コラーゲン I と可溶化基底膜マトリックス (800 μL のコラーゲン混合物 + 200 μL の基底膜マトリックス) の 4:1 混合物に筋芽細胞を再懸濁し、最終容量 1 mL に到達します。コラーゲン成分については、付属の中和剤(中和剤にコラーゲンを9:1で混ぜたもの)を添加し、混合物を1x PBSで希釈して800μLの容量にします。
3. バイオリアクターの各筋肉室に15 μLの細胞コラーゲン懸濁液を加え、ピペットチップを使用して懸濁液を両方の柱に広げます(図2)。
4. 細胞-ゲル混合物を37°Cで30分間重合させた後、各バイオリアクターウェルに450μLの筋強壮増殖培地を充填します。
5. 3日後(ゲルが圧縮された後)、筋管の分化を開始します。

5. Myotubeの分化(0-14日目)

1. 組織を450μLの融合誘導培地(FS、表1)に7日間切り替え、1日おきに培地を交換することにより、筋管注入を開始します。
   手記： 筋管の分化を miPSC からの運動ニューロンの分化と同じ日に開始して、両方の細胞タイプの分化スケジュールの終わりに運動ニューロンを播種するようにしてください。
2. 7日目に、培地を450μLの成熟培地Ia(MMIa、表1)に交換します。
3. 9日目に、450 μLの成熟培地Ib(MMIb、表1)に交換します。
4. 11日目に、培地を450μLのNbActiv4に交換します。運動ニューロンが播種されるまで、2日ごとに培地を交換し続けます(ステップ7)。

6. 運動ニューロンの分化(0-14日目)

1. 0日目に、4 x 10⁶ ChR2-hiPSCを15 mLの運動ニューロン懸濁液培地を含む超低アタッチメントシャーレに移します(MSCM、表1)。3 μM CHIR99021、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431542水和物、および 5 μM Y-27632 二塩酸塩を MSCM に添加します。
2. 2日目に、37 μMのリバーシブルストレーナーでニューロスフェア(NS)を分離し、3 μM CHIR99021、0.2 μM LDN193189、40 μMのSB431542水和物、および0.1 μMのレチノイン酸を含む15 mLのMSCMで再プレートします。2日目以降、NSは顕微鏡を使用せずにペトリ皿に見えるはずです。
3. 4日目に、細胞と培地を50mLチューブに移し、ニューロスフェアが底に落ち着くのを待ちます(5分間)。上清を吸引し、0.5 μM SAG、0.2 μM LDN193189、40 μM SB431541、および 0.1 μM レチノイン酸を添加した 15 mL の MSCM に細胞を再懸濁します。
4. 7日目に、ステップ6.3を繰り返しますが、0.5μMのSAGと0.1μMのレチノイン酸を添加した15mLのMSCMに細胞を再懸濁します。
5. 9日目に、ステップ6.3を繰り返しますが、10μM DAPTを添加した15 mLのMSCMに細胞を再懸濁します。
6. 11日目に、ステップ6.3を繰り返しますが、20 ng/mL BDNFおよび10 ng/mL GDNFを添加した15 mLのMSCMに細胞を再懸濁します。
7. 14日目に、運動ニューロンをプラットフォームに播種します。

7. バイオリアクターで運動ニューロンの凝集体を播種する(14日目)

1. 2 mg/mL のコラーゲン I とマトリゲルの 4:1 ゲル混合物を調製します (800 μL のコラーゲン混合物 + 200 μL のマトリゲルで最終容量 1 mL に到達します)。コラーゲン成分については、付属の中和剤(中和剤にコラーゲンを9:1で混ぜたもの)を添加し、混合物を1x PBSで希釈して最終容量800μLにします。
2. 400 nmのセルストレーナーを使用して大きなニューロスフェアを選択し、それらをゲル混合物に再懸濁します。
3. リザーバーから培地を吸引し、ニューロスフェアウェルから慎重に吸引します(図2)。
4. 15 μLのゲル混合物をニューロスフェアチャネルに加えます。
5. 10 μL のピペットに 10 μL のゲルをセットし、ニューロスフィアを 1 つ選びます。
6. NSをニューロスフィアチャネルに沈着させ、NSがチャンバー内にあることを確認します。NSが沈殿したら、残りのゲルを解放しながらピペットをゆっくりと上げます。NSが正しく堆積したかどうかわからない場合は、顕微鏡を使用してその位置を確認してください。
7. ゲルを37°Cで30分間重合させます。
8. リザーバーに、20 ng/mL BDNFおよび10 ng/mL GDNFを添加した450 μLのNbActiv4を加えます。
9. NSから筋肉組織への軸索成長を可能にするために、メディアを隔日で交換します。

8. NMJ機能の同時光刺激とビデオ録画 (day 24+)

1. イメージングには、倒立型蛍光顕微鏡と科学的な相補型金属酸化膜半導体(sCMOS)カメラを使用します。
2. カメラソフトウェアのビニングを2x2、露出を20 ms、ローリングシャッターをON、読み出しレートを540 MHz、ダイナミックレンジ:12ビット&ゲイン1、センサーモード:オーバーラップに設定します。
3. 顕微鏡で2倍対物レンズを使用して、微小組織を画像化します。
4. 生細胞チャンバー(37°C、5%CO₂)を顕微鏡ステージに取り付けます。
5. 神経支配骨格組織組織を含む関心領域(ROI)を選択して、ファイルサイズと処理時間を最小限に抑えます。
6. サンプルとイメージング対物レンズの間に594 nmのロングパス発光フィルターを配置して、カメラからの青色光パルスをフィルタリングします。
7. 4つのバイオリアクター(24組織)を含む長方形の4ウェルプレートを生細胞チャンバーに入れます。
8. 「ライブビュー」をクリックします。目的のROIで画像の中央に合わせ、焦点を合わせます。
9. GitHubフォルダ(https://github.com/ofvila/NMJ-function-analysis)からカスタムマクロコードをアップロードして、ステージの位置、Arduinoボード、およびビデオ集録を制御します。
10. 出力ムービーを day_tissue group_tissue name_experiment.nd2 に設定します。
11. ステージ上に設定された目的のX、Y座標でマクロコードを実行し、50フレーム/秒で1700フレームの高速タイムラプスを取得します。
12. イメージング後、培地を交換し、サンプルをインキュベーターに戻します。組織疲労を避けるために、画像取得セッションの間に少なくとも24時間余裕を持たせてください。

結果

図 1.NMJ機能の刺激、記録、分析。(A)LEDのセットアップと光路の概略図。(B)倒立顕微鏡、生細胞チャンバー、自動ステージ、sCMOSカメラによる光学セットアップ。(C)NMJ培養物の光刺激ビデオのバッチ処理のためのアルゴリズム。(D) MATLAB コードによって生成されたビデオの代表フレームと、対応する収縮性トレース グラフ。ビデオの青いボックスの点滅とグラフの縦線は、ブルーライトの刺激がいつ発生したかを示しています。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
細胞
SkMDCの	クックマイオサイト	P01059-14M
メディア&サプリメント
アドバンスドDMEM/F12	サーモフィッシャーサイエンティフィック	12634-020
ウシ血清アルブミン溶液	ミリポアシグマ	A9576-50ミリリットル
G-5サプリメント(100X)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17503から012
ジェネチシン選択的抗生物質(G418硫酸塩)(50 mg / mL)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	10131-035
インスリン、組換えヒト	ミリポアシグマ	91077C-100MG
マトリゲル	コーニング	354277
mTeSRプラス	幹細胞技術	〒100-0276
MyoTonic成長培地キット	クックマイオサイト	MK-4444
N-2サプリメント	サーモフィッシャーサイエンティフィック	17502-048
NBactiv4 500 mL	ブレインビッツLLC	NB4-500
ニューロベースルミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21103-049
ニューロベースル-Aミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A13710-01
プルロニックF-127	シグマ・アルドリッチ	P2443
リレSR	幹細胞技術	5872
プラスチック製品
30 mmケージキューブシステム	トールラボ	CM1-DCH、CP33、ER1-P4、ER2-P4
37 μm リバーシブルストレーナー、大型	幹細胞技術	27250
546 nm ショートパス励磁フィルタ	セムロック	FF01-546/SP-25
573nmダイクロイックミラー	セムロック	FF573-DI01-25x36
594nmロングパスエミッションフィルター	セムロック	BLP01-594R-25
594nmロングパス励磁フィルタ	セムロック	BLP01-594R-25
SinkPAD-II 10mm角ベース上の青色(470nm)反逆型LED - 65 lm @ 700mA	ルクセオンスターLED	SP-05-B4
Carclo 29.8° Frosted 10 mm 円形ビーム光学部品 - 脚一体型	ルクセオンスターLED	10413
Corning 60 mm 超低アタッチメント培養ディッシュ	コーニング	3261
ヒートシンク	ルクセオンスターLED	LPD-19-10Bの
光学
pluriStrainer 400 μm, 25 パック, 滅菌済み	プルリセレクト	43-50400-03
pluriStrainer 500 μm、25パック、滅菌済み	プルリセレクト	43-50500-03
SinkPAD-II 10mm角ベース上の赤色(627nm)反逆型LED - 65 lm @ 700mA	ルクセオンスターLED	SP-05-R5
リング作動式アイリスダイアフラム	トールラボ	SM1D12D
T-Cube LEDドライバー	トールラボ	LEDD1B、KPS101
金型
雌ねじ六角スタンドオフ、3 1/2 "10-32、部分的にねじ山1/2"	マクマスター	91920A046
ロープロファイルCクランプ	マクマスター	1705A12
成長要因
アデノシン3',5'-環状一リン酸	ミリポアシグマ	A9501-1Gの
CHIR 99021、10 mg	トクリス	4423から10
DAPT10ミリグラム	R&Dシステム	2634-10
ヒト CNTF、研究用グレード、5 μg	ミルテニルバイオテック	〒130-096-336
ヒトビトロネクチンタンパク質、CF	R&Dシステム	2349-VN-100
ヒトビトロネクチンタンパク質、CF	R&Dシステム	2349-VN-100
IGF1組換えヒトタンパク質	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PHG0078
ラミニンマウスタンパク質、天然	サーモフィッシャーサイエンティフィック	23017015
組換えヒトAgrinタンパク質	R&Dシステム	6624-AG-050
組換えヒトGDNFタンパク質、CF 50ug	R&Dシステム	212-GD-050/CF
組換えヒトニューロトロフィン3 100 ug	細胞科学	CRN500D
組換えヒトニューロトロフィン-4	細胞科学	CRN501B
組換えヒューマンソニックヘッジホッグ/SHH(C24II)Nターミナス	R&Dシステム	1845-SH-100
組換えヒト/マウス/ラットBDNF 50 ug	ペプロテック	450から02
レチノイン酸、50 mg	ミリポアシグマ	R2625-50
SAGスムージングアゴニスト	ミリポアシグマ	566660
SB431542 10ミリグラム	幹細胞技術	72234
ステムマックス LDN-193189	ミルテニルバイオテック	130-103-925
ヒト血漿由来のビトロネクチン	ミリポアシグマ	V8379-50UG
Y-27632二塩酸塩	トクリス	1254
抗体
α-アクチニンモノクローナル抗体(マウスIgG1)	アブカム	AB9465
コリンアセチルトランスフェラーゼ(ChAT)(ヤギ)	ミリポア	AB144Pの
デスミンmAb(マウスIgG1)	ダコ	M076029-2
ミオシン重鎖(MHC)(マウスIgG2b)	DSHBの	MF20
備品
Arduino Uno R3 (英語	Arduinoの	A000066
自動ステージ	応用科学機器	MS- 2000 XYZの
膨張プラズマクリーナー	ハリックプラズマ	PDC-001 (115V)
Invitrogen Countess 全自動セルカウンター	マーシャル・サイエンティフィック	i-CACC
IX-81 倒立型蛍光顕微鏡	オリンポス	IX-ILL100LH
シリーズステージトップインキュベーターシステム	東海ヒットSTX	東海ヒットSTXG
Zyla 4.2 sCOMSカメラ	アンドールテクノロジー	ザイラ-4.2P-CL10
ソフトウェア
Arduinoソフトウェア(IDE)	Arduinoの	IDEの1.8.19
マスターカム	マスターカム	SolidworksのMastercam
マトラブ	マトラブ	R2021bの
NIS エレメント	ニコン	基礎研究
Solidworksの3DCADの	ソリッドワークス	Solidworksスタンダード