神経細胞からのタンパク質抽出

要約

出典:Shani, T., et al. 運動ニューロン様NSC-34細胞内の核細胞質輸送をリアルタイムで測定するためのアッセイ。J. Vis. Exp.(2017年)

このプロトコルは、ニューロン癌細胞からのタンパク質の抽出を概説しています。細胞をバッファーで洗浄し、酵素的および機械的破壊によって溶解します。抽出されたタンパク質に富む上清は、遠心分離後に回収されます。

プロトコル

1. 細胞株の調製

1. 液体窒素容器に保存したマウス神経芽腫脊髄細胞(NSC-34細胞)約100万個を解凍します。細胞が完全に解凍されるまで、37°Cの水インキュベーターを使用します。
2. 新鮮で温かい培地(10%のウシ胎児血清(FBS)、1%のL-グルタミン、および1%のペン連鎖球菌抗生物質を含むDMEM培地)を追加します。
3. 解凍した細胞(SL16R)を500 x gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを形成します。培地を廃棄し、細胞の再懸濁液用に新しい培地1 mLを加えます。
4. 再懸濁した細胞を15 mLのフラスコに入れ、さらに5 mLの培地を加えます。細胞を滅菌インキュベーターで一晩インキュベートし、5% CO₂ を 37 °C でインキュベー
トします。
5. 並行して、コーティングされていないカバースリップ8枚(カバーガラス:12mm、厚さ0.13〜0.17mm)を60mmの培養皿に入れ、70%エタノールを使用して滅菌し、乾燥するまで30分間UV光をさらします。各皿に中程度の量を加え、残留エタノールを洗い流すために処分します。
6. トリプシン緩衝液(1Lのハンクス平衡塩溶液1Lにトリプシン2.5gとEDTA0.2g)を約90%のコンフルエンス(フラスコあたり約600万細胞)に達した後に細胞に加え、接着細胞が解離できるようにします
   注:NSC-34細胞は感度が高く、培地を使用して解離する前に、15秒のトリプシンバッファーインキュベーションとトリプシンを含まない1分間の追加インキュベーションのみが必要です。
7. カバースリップがすでに含まれている60 mmの培養皿に、3 mLの培地(皿あたり約350,000個)を細胞に播種します。インキュベーターに24時間放置して、細胞をカバーガラスに付着させます。

2. タンパク質発現の検証

1. 各実験群の残留細胞(上記実験では使用しなかった)を入れた60 mmの培養皿を氷上に置きます。
2. 培地を廃棄し、細胞をPBSで2回洗浄して、残りの培地を希釈して洗浄します。
3. PBS、0.5% Triton、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル錠(PI)を含む200-400 μLの溶解緩衝液で細胞を処理します。セルスクレーパーを使用してこすります。
4. 細胞を微量遠心チューブ内の溶解バッファーに集め、ホモジナイザーで4,000rpmで氷下1分間ホモジナイザーでホモジナイズします。
5. ホモジナイズした細胞を2,500 x gで10分間遠心分離し、上清を回収し、Bradfordアッセイを使用してタンパク質濃度を定量し、使用するまで-20°Cで保存します。
6. 30〜70 μgの総タンパク質(タンパク質によって異なります)を回収し、SDS-PAGEゲルにロードして、イムノブロットアッセイを使用してタンパク質発現を試験します。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マウス運動ニューロン様ハイブリッド細胞株(NSC-34)	テブバイオ	CLU140-A型
DMEM 4.5g/L L-グルコース	バイオ産業	01-055-1A
FBSヨーロピアングレード	バイオ産業	04-007-1A
SL 16R 遠心分離機	サーモサイエンティフィック	75004030
Thermo Forma Series ii ウォータージャケット付き CO2 インキュベーター	サーモサイエンティフィック	3111さん
カバーガラス直径12mm厚0.13-0.17mm	バー・ナオール株式会社
Axiovert 100倒立顕微鏡	ツァイス
レプトマイシンB	シグマ	L2913
PBSの	バイオ産業	02-023-1A
ホモジナイザーモーター/制御/チャック/90度クランプ	グラスコル	099C K5424CE
MicroCL 17R 遠心分離機、冷蔵	サーモサイエンティフィック	75002455