1. ビオチン化によるアストロサイトにおける細胞表面タンパク質の相対発現の測定
>注:ここでは、このビオチン化技術を、細胞外マトリックス分子ラミニンが水透過性チャネルアクアポリン-4(AQP4)の細胞表面局在に及ぼす影響の研究に応用する方法を示します。このアッセイに必要な特殊な材料には、スルホ-NHS-LC-ビオチン(スルホスクシンイミジル6-(ビオチンアミド)ヘキサン酸)およびストレプトアビジン-アガロース樹脂が含まれます(材料の表を参照)。
- この方法を使用して、アッセイの約2週間前に皮質アストロサイトの培養物を調製し、75 cm2のベント付き培養フラスコで増殖させます。アストロサイトが80〜90%コンフルエントになったら、0.05%トリプシンを使用して培養表面からアストロサイトを引き離し、1:3で通過させます。
- アッセイの48時間前に、細胞が再び80〜90%コンフルエントになったら、アストロサイトを1:3(培養フォーマットの変更を考慮)を60 mmの細胞培養皿に1:3(培養フォーマットの変更を考慮)に継ぎ、実験が行われる日に>70%コンフルエントになるようにします。細胞が皿間で均等に分布していることを確認します。
- アッセイの16時間前に、ラミニンを最終濃度24 nMまで培地にピペットで移し、37°Cでインキュベートします。
- アッセイの直前に、以下を準備し、氷上または冷蔵します:CM-PBS(100 mg/L MgCl2∙6H2Oおよび100 mg/L CaCl2 in 1X phosphate-buffered saline [PBS]、pH 7.4)、ビオチン緩衝液(0.5 mg/mL sulfo-NHS-LC-biotin in CM-PBS)、クエンチングバッファー(50 mM NH4Cl in CM-PBS)、溶解バッファー(25 mM Tris、 pH 7.4、25 mM グリシン、150 mM NaCl および 5 mM エチレンジアミン四酢酸 [EDTA]、1% トリトン X-100、1X プロテアーゼ阻害剤カクテル)、3X ローディングバッファー (150 mM トリス、pH 6.8、6% ドデシル硫酸ナトリウム [SDS]、30% グリセロール、300 mM ジチオスレイトール [DTT] および 0.01% ブロモフェノールブルー)、および洗浄バッファー (10 mM トリス (pH 7.4)、1.5 mM EDTA、 150 mM NaCl、1% Triton X-100、1X プロテアーゼ阻害剤カクテル)。
- アストロサイト培養物を保持している皿をインキュベーターから取り出し、培地を廃棄します。
- 冷やしたCM-PBS4mLで細胞を3回洗浄し、砕いた氷の上に皿を置きます。
- 2 mLのビオチンバッファーを各ウェルにピペットで注入し、ディッシュを数回前後にゆっくりと傾けて、完全にカバーされるようにします。氷の上に30分間置きます。
- アスピレーターを使用してビオチンバッファーを取り外し、4 mLのクエンチングバッファーと交換します。氷の上に10分間放置します。
- クエンチングバッファーを吸引し、同量のものと交換します。再び、氷の上に10分間置きます。
- クエンチングバッファーを廃棄し、冷やしたCM-PBS4 mLで細胞を3回洗浄します。
- セルリフターを使用して細胞を冷やしたCM-PBS1 mLに掻き取り、懸濁液を微量遠心チューブに移します。
- 100 x gで3分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄し、細胞を500 μLの溶解バッファーに再懸濁します。
- サンプルを氷上に30分間放置し、5分ごとにボルテックスするか、4°Cのエンドオーバーエンドローテーターに置きます。
- ライセートを14,000 x gで4°Cで10分間遠心分離し、界面活性剤に不溶性の物質をペレット化します。上清を新しい微量遠心チューブに移します。
- このライセートを50 μL保存し、ローディングバッファーを添加します。次に、ドライバスで95°Cに加熱して変性させます。これは、ビオチン化細胞表面タンパク質と非ビオチン化細胞質タンパク質の両方を含む「インプット」画分です。
- ピペットの先端の開口部を広げるには、鋭利なハサミでピペットの先端から約0.5cmの材料を切り取ります。このピペットチップを使用して、75 μLのストレプトアビジン-アガロースビーズ(通常は4°Cで保存)をライセートに移し、シェーカー/ロッカーで4°Cで3時間インキュベートします。
- ストレプトアビジン-アガロースは、ビーズを体積で50%含有し、抗菌溶液に懸濁したスラリーとして販売されることが多いため、ビーズが均一に懸濁するようにスラリーを粉砕し、懸濁液150μLを各サンプルにピペットで注入します。
- ストレプトアビジン-アガロースビーズのペレットを1500 x g、4°C、30秒間遠心分離。
- 上清を50 μL保存します(ローディングバッファーを添加し、ウォーターバスまたは加熱ブロックで95°Cで変性させます)。これは「細胞内」画分を表し、主に非ビオチン化細胞質タンパク質で構成されています。
- ペレット化したビーズを1 mLの洗浄バッファーに再懸濁し、これを4°Cで3分間揺とうします。ペレットビーズ(ステップ1.16と同様)を調製し、上清を捨てます。このプロセスを4回繰り返して、非ビオチン化細胞質タンパク質の非特異的結合を最小限に抑えます。
- 遠心分離(1500 x g、4°Cで30秒間)によりビーズをペレット化し、その上にある洗浄バッファーを廃棄します。50 μLの1X loading buffer(溶解バッファーを使用して希釈)を加えます。ビオチンとストレプトアビジンをビーズから放出し、これを95°Cで変性させます。この画分には、ビオチン化された細胞表面タンパク質のみが含まれている必要があります(「細胞表面画分」)。
- SDS-PAGE(ナトリウムドデシル硫酸塩-ポリアクリルアミドゲル電気泳動)によりインプット画分、細胞表面画分、細胞内画分を分離し、ウェスタンブロッティングにより解析します
手記： 実験では4〜20%のプレキャストグラジエントゲルを使用しましたが、この研究で関心のあるタンパク質には、4%のスタッキング層(それぞれ0.1%のSDSを含む)を備えた12〜14%の分離ゲルで十分です。適切なサイズ範囲の分子量標準も使用する必要があります。ビオチン化タンパク質の見かけの分子量に観察可能な増加が見られる場合があることに注意してください。