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動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。
1. ビオチン化によるアストロサイトにおける細胞表面タンパク質の内在化速度の測定
>注:以下では、アストロサイトにおけるAQP4のエンドサイトーシスを追跡するために、このインスタンスで使用された典型的なパルスチェイスビオチン化実験について説明します。必要な特殊材料には、スルホ-NHS-SS-ビオチン、ストレプトアビジン-アガロース樹脂、還元型グルタチオン、ヨードアセトアミドなどがあります(材料の表を参照)。
- 前のセクションで概説した方法を使用して、マウス皮質アストロサイトの培養物を60mm皿で調製します。アッセイ当日に細胞が約70%コンフルエントであること、および各皿に同数の細胞が含まれていることを確認してください。
- アッセイの直前に、以下を準備し、氷上に置くか冷蔵します:CM-PBSまたはリン酸緩衝生理食塩水(100 mg / L MgCl2・6H2Oおよび100 mg / L CaCl2 in 1X PBS、pH7.4)、ビオチン緩衝液(0.5 mg / mL sulfo-NHS-SS-biotin in CM-PBS)、還元緩衝液(50 mM還元型グルタチオン、75 mM NaClおよび75 mM NaOH)、 クエンチングバッファー(50 mMヨードアセトアミド、1%BSA、CM-PBS中)、溶解バッファー(25 mMトリス、pH 7.4、25 mMグリシン、150 mM NaClおよび5 mM EDTAまたはエチレンジアミン四酢酸、1%トリトンX-100、1Xプロテアーゼ阻害剤カクテル)、3Xローディングバッファー(150 mMトリス、pH 6.8、6%SDSまたはドデシル硫酸ナトリウム、30%グリセロール、300 mM DTTまたはジチオスレイトール、0.01%ブロモフェノールブルー)、 および洗浄バッファー(10 mM Tris、pH 7.4、1.5 mM EDTA、150 mM NaCl、1% Triton X-100、1X protease inhibitor cocktail)。
- 新鮮な細胞培養培地(Dulbecco's Modified Eagle Medium、またはDMEMに10%ウシ胎児血清(FBS)、1%ペニシリン/ストレプトマイシン、および1%L-グルタミンを添加)を調製し、37°Cの水浴に入れます。
- インキュベーターからアストロサイト培養物を取り出し、吸引器を使用して培地を吸引します。
- 冷やしたCM-PBS4mLで細胞を3回洗浄し、砕いた氷の上に皿を置きます。
- 3 mLのビオチン緩衝液を各皿にピペットで入れ、緩衝液が十分に分布していることを確認するために皿を数回前後に傾け、氷上に30分間放置します。
- ビオチンバッファーを吸引し、5 mLの温かい培地と交換します。培養皿を37°Cで15分間インキュベートし、2番目の皿を同じ温度で30分間インキュベートします。別の皿を4°Cに0分間のサンプルとして残します。
- インキュベーション期間の終了時に、培地を廃棄し、4mLの冷やしたCM-PBSで細胞を3回洗浄します。細胞上に6mLの還元緩衝液をピペットで移し、氷上に15分間放置します。
- 還元性緩衝液を取り出し、6 mLの新鮮な還元性緩衝液と交換します。混合物をさらに15分間氷の上に置きます。
- 還元液を取り出し、6 mLのクエンチングバッファーと交換します。氷の上に15分間置きます。
- 焼入れ手順をもう一度繰り返します。
- クエンチングバッファーを廃棄し、4mLの冷やしたPBSで細胞を3回洗浄します。
- セルリフターを使用して、細胞を1 mLの冷やしたPBSに掻き取り、懸濁液を微量遠心チューブに移します。
- 100 x gで3分間遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄し、細胞を500 μL溶解バッファーに再懸濁します。
- これを氷上に30分間放置し、5分ごとに渦巻きます。あるいは、この時間、サンプルを4°Cのエンドオーバーエンドローテーターに置きます。
- ライセートを14,000 x gで4°Cで10分間遠心分離し、界面活性剤不溶性材料をペレット化し、上清を新しい微量遠心チューブに移します。このライセートを50 μL保存し、ローディングバッファーを添加し、ドライバスで95°Cで変性させます。これは、ビオチン化エンドサイトーシスタンパク質と非ビオチン化タンパク質の両方を含む「インプット」画分です。
- カットしたピペットチップを使用して、150 μLのストレプトアビジン-アガローススラリーをライセートに加え、シェーカー/ロッカーで4°Cで3時間インキュベー
トします。
- ストレプトアビジン-アガロースビーズのペレットを1,500 x gで4°C、30秒間遠心分離。
- ビーズを1 mLの洗浄バッファーに再懸濁し、4°Cで3分間ロックします。ペレットビーズ(ステップ1.18による)を行い、上清を捨てます。このプロセスを4回繰り返して、非ビオチン化細胞質タンパク質の非特異的結合を最小限に抑えます。
- 1,500 x gで4°C、30秒間遠心分離してビーズをペレット化し、その上にある洗浄バッファーを廃棄します。50 μL 1X ローディングバッファー (溶解バッファーを使用して希釈) を添加します。ビオチンとストレプトアビジンをビーズから放出し、95°Cで変性させます。この画分は、内在化された細胞表面タンパク質のみを含むべきである(「エンドサイトーシス」画分)。
- ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)により、インプット画分、細胞表面画分、非結合画分を分離し、ウェスタンブロッティングで分析します
手記：実験では4〜20%のプレキャストグラジエントゲルを使用しましたが、この研究で関心のあるタンパク質には、4%のスタッキング層(それぞれ0.1%のSDSを含む)を備えた12〜14%の分離ゲルで十分です。適切なサイズ範囲の分子量標準も使用する必要があります。ビオチン化タンパク質の見かけの分子量に観察可能な増加が見られる場合があることに注意してください。