ビオチン誘導体を用いた標的表面タンパク質のインターナリゼーションの評価

Abstract

出典: Tham, D. K. L., et al., Determining Cell-surface Expression and Endocytic Rate of Proteins in Primary Astrocyte Cultures Using Biotinylation. J. Vis. Exp. (2017年)。

このビデオでは、ビオチン化を使用してマウス皮質アストロサイトの標的タンパク質のインターナリゼーションを評価する方法を示し、その後、細胞溶解、ストレプトアビジンベースのタンパク質抽出、変性、およびウェスタンブロット分析を行い、インターナリゼーションの成功を確認する方法を示します。

Protocol

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. ビオチン化によるアストロサイトにおける細胞表面タンパク質の内在化速度の測定

>注:以下では、アストロサイトにおけるAQP4のエンドサイトーシスを追跡するために、このインスタンスで使用された典型的なパルスチェイスビオチン化実験について説明します。必要な特殊材料には、スルホ-NHS-SS-ビオチン、ストレプトアビジン-アガロース樹脂、還元型グルタチオン、ヨードアセトアミドなどがあります(材料の表を参照)。

1. 前のセクションで概説した方法を使用して、マウス皮質アストロサイトの培養物を60mm皿で調製します。アッセイ当日に細胞が約70%コンフルエントであること、および各皿に同数の細胞が含まれていることを確認してください。
2. アッセイの直前に、以下を準備し、氷上に置くか冷蔵します:CM-PBSまたはリン酸緩衝生理食塩水(100 mg / L MgCl₂・6H₂Oおよび100 mg / L CaCl₂ in 1X PBS、pH7.4)、ビオチン緩衝液(0.5 mg / mL sulfo-NHS-SS-biotin in CM-PB....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ウシ血清アルブミン	シグマ・アルドリッチ	A9647-50 (英語
ブロモフェノールブルー	バイオ・ラッド	#1610404
完全プロテアーゼ阻害剤カクテル	シグマ・アルドリッチ	11697498001
エチレンジアミン四酢酸二ナトリウム二水和物(EDTA)	バイオ・ラッド	#1610729
ジチオスレイトール(DTT)	バイオ・ラッド	#1610611
ダルベッコのモディファイドイーグルミディアム(DMEM)	Gibco/サーモフィッシャーサイエンティフィック	11960-044
EZ-Linkスルホ-NHS-SS-ビオチン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	#21331
ウシ胎児血清	Gibco/サーモフィッシャーサイエンティフィック	16000-044
グリセロール	フィッシャーサイエンティフィック	BP229-1
グリシン	シグマ・アルドリッチ	G8898
ヨードアセトアミド	バイオ・ラッド	#163-2109
L-グルタミン	Gibco/サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒25030-081
ペニシリン/ストレプトマイシン	Gibco/サーモフィッシャーサイエンティフィック	15140-122
ペルオキシダーゼアフィニピュアヤギ抗ウサギIgG(H + L)	ジャクソン免疫研究所	111-035-045
リン酸緩衝生理食塩水	Gibco/サーモフィッシャーサイエンティフィック	〒10010-023
還元型グルタチオン	シグマ・アルドリッチ	G6529
塩化ナトリウム(NaCl)	フィッシャーサイエンティフィック	S271-500
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)	シグマ・アルドリッチ	862010
水酸化ナトリウム(NaOH)	フィッシャーサイエンティフィック	S318-100
ストレプトアビジンアガロース樹脂	サーモフィッシャーサイエンティフィック	#20347
ウサギポリクローナル抗AQP4抗体	アロモーネ	AQP-004
トリスベース(Trizmaベース)	フィッシャーサイエンティフィック	BP152-1
トリス-HCl	フィッシャーサイエンティフィック	BP153-1
トリトンX-100	フィッシャーサイエンティフィック	BP151-500