海馬ニューロンを用いたタンパク質の引力活性または反発活性の評価

要約

出典:Yamagishi, S. et al., Stripe Assay to Study the Attractive or Repulsive Activity of a Protein Substrate Using Dissessated Hippocampal Neurons. J. Vis. Exp. (2016)

このビデオは、パターン化されたタンパク質ゾーン上の海馬ニューロンを使用してタンパク質活性を評価する方法を示しています。ニューロンは、試験タンパク質ゾーンでは反発を示し、制御タンパク質ゾーンでは付着を示し、引力的または反発的なタンパク質活性の影響を強調しています。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 行列の準備

1. 4〜8個のシリコンマトリックスを電子レンジまたはホットプレートで5分間煮沸し、層流(縞模様の面を上にして)で1時間完全に乾燥させます<> 手記： 次の手順は、層流下で実行する必要があります。
2. 圧縮空気を吹き飛ばすか、透明な粘着テープを使用して、マトリックスの縞模様の面からほこりを取り除きます。縞模様の面は、プレート表面にしっかりと密着するように清潔に保ちます。
3. 指で押して、マトリックスを6cmのプラスチック皿に慎重に置きます(皿ごとにマトリックス1つ、ストライプ面を下にして)。マトリックスと皿の間に気泡が入らないようにしてください。培養皿の底面にあるストライプの位置をマークします。
4. マトリックスのアタッチに失敗した場合は、手順 1.2 から繰り返します。

>2. ニューロン培養のためのストライプ生成とラミニンコーティング

1. Fcタグ付きタンパク質(10-50 μg/ml)と蛍光色素標識抗ヒトFc抗体(1:30-150 μg/ml)をリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に混合して、蛍光標識組換えタンパク質(注射用[ステップ2.2]用各25 μl、または配置方法用[ステップ2.2.1]用各100 μl)を調製します。次に、混合物をRTで30分間インキュベートします。
2. 22-Gシリンジを使用して、前のステップで調製した組換えタンパク質25 μlをマトリックスの側面の小さな穴(図1A、1C、および1Eの矢印)に注入します。
   1. あるいは、組換えタンパク質100μlをマトリックスの上部スリットに入れ、小さな穴(図1A、1C、および1Eの矢印)から溶液の約半分を吸引して、組換えタンパク質が縞模様の領域に残るようにします。
3. ディッシュを細胞培養インキュベーターで37°Cで30分間インキュベートします。
4. 300 μlのPBSを上部のスリット (図 1B) に入れ、マトリックスの側面にある小さな穴 (図 1A、C、Eの矢印) から吸引して、付着していない組換えタンパク質を除去します。タンパク質が乾燥するため、PBSを完全に吸引しないでください。この手順を 2 回繰り返します。(計3回)
5. マトリックスを慎重に取り除き、直ちに~100 μlのコントロールタンパク質 (10-50 μg/ml;Fc)縞模様の領域全体を覆い、代替コーティングを作成します。次に、細胞培養インキュベーターで皿を37°Cで30分間インキュベートします。
6. PBSで皿の表面を3回洗浄した後、PBSに~100μlの20μg/mlラミニンをコーティングします
   手記：ラミニンは固化を防ぐために氷の上で解凍する必要があります。
7. 細胞培養インキュベーターで皿を37°Cで1時間インキュベートします。
8. 皿の表面をPBSで3回洗い、培地を加えます。コーティングした培養液入りのディッシュを、使用するまで37°Cの5%_CO2インキュベーターに入れます。

3. E15.5マウス胚からの海馬ニューロンの培養

1. 子宮頸部脱臼によって母親を安楽死させ、3つのE15.5胚を分離します。
2. ハサミで頭の正中線で皮膚と頭蓋骨を矢状に切り、小さなスプーンで脳を取り出します。3 mlのハンク平衡塩溶液(HBSS)を含む60 mmのシャーレに脳を慎重に移します。.
3. メスを使用して、皮質、海馬、線条体を含む半球を切り取ります(図2A)。次に、髄膜を慎重に除去して海馬領域を解剖し、解剖した海馬組織を氷上で2mlのHBSS溶液を含む15mlの遠心チューブに移します(図2B-C)。チューブ内の3つの胚から6つの海馬を採取し、8つの皿でニューロンを培養するのに十分です。
4. HBSS溶液をトリプシン/エチレンジアミン四酢酸(トリプシン/ EDTA)溶液(2 mL)と交換し、チューブを37°Cで15分間水浴中でインキュベートします><。 手記：遠心分離せずにHBSSを吸引し、チューブを傾けてHBSS溶液をデカントしないでください。
5. トリプシン活性を中和するには、500 μlのウシ胎児血清 (FBS) を添加します。
6. 混合物を100 x gで5分間遠心分離し、上清を取り除き、ペレットを2 mLの培地で洗浄します。この手順をもう一度繰り返します。
7. 大きな穴(カットチップ)のある1,000μlのチップを使用して、培地で海馬を10回上下にピペッティングし、組織を解離します。
8. 通常の(カットされていない)1,000 μlチップに交換し、解離した組織を上下にピペッティングして、単一細胞懸濁液を得ます。
9. 1つのセルを80-100μmメッシュのセルストレーナーに通して分離します。
10. ろ過したシングルセル懸濁液を150 x gで5分間遠心分離します。
11. 吸引して上清を取り除き、ペレット(ニューロン)を2mlの培地に再懸濁します。
12. トリパンブルー染色を施した血球計算盤を使用して細胞をカウントし、密度と生存率を決定します。次に、10,000個のニューロンを150 μlの培地に播種します。サスペンションは、ストライプ領域全体を覆うように慎重に配置する必要があります。

結果

図 1.縞模様のタンパク質スタンプを作成するために使用されるシリコンマトリックス。(A、B) シリコンマトリックスの上面図。マトリックスのサイズは30mm×25mm×5mmです。Aの白い矢印は、組換えタンパク質が注入される小さな穴を示しています(ステップ2.2)。Bの矢印は、組換えタンパク質が交互に適用されるスリットを示しています(ステップ2.2.1)。(C、D) シリコンマトリックスの底面図。縞模様の領域のサイズは7 mm x 9 mmです。各ストライプの幅は90μmです。矢印は、組換えタンパク質が注入される小さな管を示しています。(E)マトリックスの正中線にある矢状図の概略図で、小さな穴、ストライプ、およびスリットの間の接続を示しています。矢印は注入穴を示します。スケールバーは、ACで500μm、Dで200μmです。

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材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
15 mL遠心チューブ	ビオラモ	1-3500-01
Alexa Fluor 488 ヤギ抗ヒトIgG抗体	サーモサイエンティフィック	A11013 (英語)
Alexa Fluor 594 Donkey抗マウスIgG抗体	サーモサイエンティフィック	A-21203	希釈率 1/500
B27サプリメント	サーモサイエンティフィック	17504-044	希釈率 1/50
ウシ血清アルブミン	シグマ	2030年01月2
セルストレーナー 100 um	BDファルコン	352360
遠心分離機	クボタ	2410
DAKOペン	だこ	S2002	代替の撥水ペンを使用することもできます
使い捨てメス	羽	2975年#11
FBSの	サーモサイエンティフィック	〒10437-028
鉗子No.5	ファインサイエンスツール	11254から20
グルタマックス	サーモサイエンティフィック	35050-061	希釈率 1/200
ハミルトンシリンジ	ハミルトン	805N	22ゲージ、50 uL
HBSSの	サーモサイエンティフィック	14170-112
ヒトIgG、Fcフラグメント	ジャクソン	009-000-008
ラミニン	サーモサイエンティフィック	23017-015
神経基礎	サーモサイエンティフィック	21103-049
PBSの	ナカライ	14249から24
ペニシリン-ストレプトマイシン	サーモサイエンティフィック	15070-063	希釈率 1/100
プラスチック培養皿、60 mm	サーモサイエンティフィック	150288
シリコーンマトリックス			Martin Bastmeyer教授(bastmeyer@kit.edu)から入手可能で購入可能です。
実体顕微鏡	オリンポス	SZ61
チップ、1000 uL	ワトソン	125-1000S
透明粘着テープ	テサ	57315	代替の粘着テープを使用することもできます
トリパンブルー、0.4%	バイオ・ラッド	〒145-0013
トリプシン/EDTA	サーモサイエンティフィック	〒25300-054
培地			神経基礎にはB27、GlutaMAX、ペニシリン-ストレプトマイシンが補充されています。