マウス脳への外傷性脳損傷の送達

要約

出典: Zhong, J., et al. Intravital Imaging of Fluorescent Protein Expression in Mice with a Closed-Skull Traumatic Brain Injury and Cranial Window Using a Two-Photon Microscope. J. Vis. Exp. (2023)

このビデオは、マウスでの外傷性脳損傷(TBI)の送達を示しています。頭蓋骨を露出させた後、TBIサイトがマークされます。次に、マウスをTBIデバイスの下に配置します。衝撃は、金属棒を持ち上げ、頭蓋骨と接触しているインパクターに自由に落下させることによってもたらされます。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

1. 反復性外傷性脳損傷(TBI)誘発の投与

>注:TBIパラメータは、TBIの影響が一度配信された以前のレポートから調整されます。ここでのプロトコルは、影響の総数を 10 に増やすことを除いて、同じパラメータを適用します。

1. TBI機器
   1. 図1Bに示すように、カスタムビルドのポータブルデバイスを使用して、閉じた頭蓋骨TBI(図1A)を右側のマウスヘッドに投与します。
2. 手術前の準備
   1. 通常のハサミ、外科用ノギス、外科用スプリングハサミ、外科用鉗子、蚊鉗子、ヘッドポストピース、ガーゼ、綿先端アプリケーターなどのオートクレーブ手術機器。
   2. 手術の2時間前にマウスの体重を量り、記録します。頭蓋窓移植中の脳浮腫を最小限に抑えるには、インスリン注射器を使用して、デキサメタゾンリン酸ナトリウムを4.8 mg / kg [2 mg / mL、通常は~70μl(2つの部位に注射する必要がある)]の用量で大腿四頭筋に注射します。.デキサメタゾンの注射後、TBI手術を開始する前に、ステップ2.1に示されているようにガラス窓を後で使用するために準備します。.
   3. 75%エタノールを使用して手術ステージとTBI機器を消毒します。使い捨ての滅菌外科用ドレープを広げて、脳定位固定装置プラットフォームの手術段階を覆います。暖房装置と温度モニターの電源を入れ、目標温度を37°Cに設定します。
   4. 酸素タンクバルブを開き、酸素流量を1.5 L / minに調整します><。 注:100%純粋な酸素は、動物がTBIの影響を生き残るのを助けることができます。
   5. マウスを誘導チャンバーに入れ、5分間放置して完全な麻酔を行います。
   6. マウスが完全に麻酔されたら(つまり、2秒あたり約1サイクルでゆっくりとした安定した呼吸速度を行い、尻尾つまみ反射がない)、マウスを誘導チャンバーから取り出し、マウスの頭部を定位固定装置フレームに配置します。
   7. 麻酔チューブのノーズコーンをマウスの鼻の上に置きます。
   8. 手術が終了するまで、1.5%イソフルランと100%純酸素を混合して1L/minの流量で麻酔を維持します。定期的に呼吸の頻度をチェックし、手術中は少なくとも15分ごとに尻尾またはつま先をつまんで、適切な麻酔を評価します。必要に応じてイソフルラン濃度を調整して、麻酔の望ましい深さを維持します。.
3. TBI手術
   1. 使い捨てインスリン注射器を使用してブプレノルフィン(1 mg / kg、皮下)を投与し、マウスの眼に眼科用軟膏を塗布します。.
   2. ハサミ1で毛をトリミングし、脱毛剤を1分間塗布して、頭のてっぺんから毛を取り除きます
      注意:脱毛剤製品は皮膚刺激物であるため、頭皮に3分以上塗布しないでください。.また、マウスの目に脱毛剤が入らないようにしてください。
   3. ガーゼと綿の先端のアプリケーターを塗って頭皮の肌をきれいにします。次に、最初に75%エタノールを使用し、次にベタジンを使用して皮膚を消毒します。これを3回繰り返し(つまり、エタノールに続いてベタジン)、ベタジンの最終的な塗布を皮膚に残します。
   4. 麻酔の深さを再確認して、マウスが完全に麻酔されていることを確認します(つまり、2秒あたり約1サイクルでゆっくりとした安定した呼吸速度と、テールピンチ反射がないことを確認します)。外科用鉗子3で皮膚をテントで覆い、目から約3mm後方から12〜15mmの長さの正中線切開を行います。
   5. スプリングハサミ2を使用して、頭蓋骨の左右半球の上の皮膚を切除します。
   6. 頭蓋骨が露出したら、滅菌綿の先端のアプリケーターで骨膜を優しくこすり、滅菌生理食塩水で洗い流して骨膜を取り除きます。
   7. 頭蓋骨の状態を目視検査して、以前のウイルス注射手術でできた2つの小さな穴を除いて、頭蓋骨が無傷であることを確認します。
   8. 頭蓋骨領域を乾燥させ、TBI衝撃部位を次の座標でマークします:Bregmaの後方2.5 mm、矢状縫合糸から右側2 mm(図1B)。
   9. マウスを脳定位固定装置フレームからすばやく取り外し、TBIデバイスの下のバッファークッションに頭を置きます。
   10. インパクターの先端をマークされた衝撃部位に合わせます。
   11. テザー付きナイロンストリングをマウスの頭から15 cm上に引っ張って金属柱を持ち上げ、離すと、TBI部位の頭蓋骨上部に接触しているトランスデューサーロッドに重量が自由に落下します。TBIインパクトを与えるときは、マウスの頭に触れないでください。
   12. マウスをヒーティングブランケットに移し、呼吸状態を監視しながら仰向けに置きます。
   13. マウスが仰臥位から腹臥位になったら、3%イソフルランと100%純酸素を混合した状態で、1.5 L/minの流量でイソフルラン誘導チャンバーに~5分間置きます。
   14. マウスが完全に鎮静されたら(つまり、2秒あたり約1サイクルでゆっくりとしたが安定した呼吸速度と、尾部ピンチ反射がない場合)、手順1.3.9〜1.3.14を繰り返して、合計10回の衝撃を達成します。
       注:私たちの研究では、10のTBIの影響がマウスの死亡率が低く、堅牢な表現型を誘発することがわかっています(データはまだ公開されていません)。パラメータは、衝撃の数および/または体重が解放される高さを増減することにより、脳損傷の異なる重症度を達成するように調整されてもよい。すべてのパラメータは、現地のIACUCによる承認が必要です。
   15. 手術用顕微鏡で頭蓋骨をチェックし、頭蓋骨骨折が発生した場合はマウスを研究から外します。
   16. 偽の手術の場合は、動物をインパクターの下に置くなど、上記と同じ手順に従いますが、TBIの衝撃は提供しません。
   17. マウスが10回目のTBI衝撃を受けて仰臥位から腹臥位になった後、イソフルラン誘導チャンバーに~5分間置きます。次に、手順1.2.6-1.2.8に従って、マウスの頭を以下に説明する頭蓋窓移植手術の定位固定装置フレームに配置します。

結果

図1:TBIデバイス、TBIの影響サイト、およびウィンドウの準備の図。(A)ウェイトドロップTBIデバイス用の機器。1:台座、2:ブラケット、3:調整可能なクランプ、4:ナイロンストリング、5:ウェイトドロップトンネル、6:金属ウェイトコラム(50 g)、7:インパクター、8:バッファークッション。(B)ウイルス注射とTBI衝撃部位の概略図で、座標はブレグマの後方に2.5 mm、矢状縫合から右側に2 mmです。(C)ガラス窓を準備するための概略図。直径3mmと5mmの2枚のガラスカバーガラスを光学接着剤で組み合わせます。(D)金属製のヘッドポストとイメージングウェルの写真。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
調整可能な精密アプリケーターブラシ	パーケル	S379
BDインスリンシリンジ	BDの	NDC/HRI#08290-3284-38	5/16インチ x 31G
ベタジン	パデュー	NDC67618-151-17	7.5%ポビドンヨウ素を含む
ブプレノルフィン	PARファーマシューティカル	NDCの42023-179-05
エトナール	フィッシャーサイエンティフィック	04355223EA	75パーセント
暖房器具	CWEの	TC-1000マウス	脳定位固定装置を装備し、手術手術中に使用できます
ヒーティングブランケット	CVS薬局	E12107	追加の加熱装置と手術後に使用されます
潤滑剤眼科用軟膏	ピケタール	NDCの46066-753-55
マーカーペン	デラスコ	SMP-BK
蚊の鉗子	カロライナ	アイテム #:625314	ステンレス鋼、湾曲、5インチ
脱毛剤	マッケソンコーポレーション	該当なし	Nair Hair Aloe & Lanolin Hair Removal Lotion (ネアヘアアロエ&ラノリン脱毛ローション)
レギュラーハサミ1	ユーロスタット	ユーロスタットES5-300
レギュラーハサミ2	世界の精密機器	番号 501759-G
塩田	バイオワールド	L19102411PR
スプリングシザー 1	世界の精密機器	番号 91500-09	先端はまっすぐ
スプリングシザー2	世界の精密機器	番号 91501-09	先端はまっすぐ
脳定位固定装置プラットフォーム	コップフ	モデル900LS
外科用鉗子 1	電子顕微鏡科学	ネコログ# 0508-5/45-PO	スタイル5/45、湾曲
外科用鉗子2	電子顕微鏡科学	catlog#0103-5-PO	スタイル5、ストレート
外科用鉗子3	電子顕微鏡科学	catlog#72912
外科用鉗子4	電子顕微鏡科学	ネコログ# 0508-5/45-PO	スタイル5/45、湾曲
サージカルランプ	ライカ	ライカKL300 LED
Vetbondティッシュ接着剤	3Mアニマルケア	部品番号:014006

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