マイクロ流体チップ内のラット海馬ニューロンの蛍光免疫染色

要約

出典:Nagendran, T., et al., 初代マウスニューロンを区画化するための組み立て済みプラスチックマイクロ流体チップの使用。 J. Vis. Exp. (2018年)

このビデオは、ニューロンの成熟と接続性を分析するために、マイクロ流体チップ内で培養されたラット海馬ニューロンの免疫蛍光染色を示しています。

プロトコル

1. チップ内の蛍光免疫染色

1. PBS(4%ホルムアルデヒド、1 μM MgCl₂、0.1 μm CaCl₂、120 mMスクロース)に4%ホルムアルデヒド固定溶液を調製します。
2. チップのウェル内のほとんどのメディアを取り除きます(内部コンパートメントを乾燥させないでください)。
3. すぐに100μLの固定溶液を軸索コンパートメントと体細胞コンパートメントの上部ウェルに加えます。
4. 1分後、100 μLの固定溶液をボトムウェルに加えます。室温で30分間固定します。
5. チップのウェルからほとんどの溶液を取り除きます(内部コンパートメントを乾燥させないでください)。すぐに150μLのPBSを軸索および体細胞コンパートメントのそれぞれの上部ウェルに加えます。PBSがボトムウェルに流れ込むまで2分待ちます。
6. 手順 1.5 を 2 回繰り返します。
7. チップのウェルからPBSの大部分を取り除きます。直ちに、0.25% TritonX-100を含むPBS150 μLを軸索および体細胞コンパートメントの各上部ウェルに加えます。15分待ちます。
8. チップのウェルからほとんどの液体を取り除き、すぐに150μLのブロッキング溶液(PBS中の10%正常ヤギ血清)を軸索コンパートメントと体細胞コンパートメントの各上部ウェルに加えます。15分待つ.
   手記： 効果的なブロッキング溶液は二次抗体に特異的であるべきで、例えば、ロバ抗ヒツジ二次抗体の場合、ブロッキング溶液にロバ血清を使用してください。
9. チップのウェルからほとんどの液体を取り出し、直ちにPBS中の1%正常ヤギ血清中の一次抗体(または抗体)100 μLを軸索コンパートメントおよび体細胞コンパートメントの上部ウェルのそれぞれに加えます。蒸発を最小限に抑えるように蓋をし、室温で1時間、または一晩4°C待ちます。
10. チップのウェルからほとんどの溶液を取り除きます(内部コンパートメントを乾燥させないでください)。すぐに150μLのPBSを軸索および体細胞コンパートメントのそれぞれの上部ウェルに加えます。PBSがボトムウェルに流れ込むまで5分待ちます。
11. 手順1.10を2回繰り返します。
12. チップのウェルからほとんどの液体を取り出し、すぐにPBS中の100 μLの二次抗体(または抗体)を軸索コンパートメントと体細胞コンパートメントのトップウェルのそれぞれに加えます。蒸発を最小限に抑えるためにカバーをし、室温で1時間待ちます.
    手記： 二次抗体の推奨希釈については、製造元の指示書を参照してください。
13. 手順1.10〜1.11を繰り返します。
14. 免疫染色後1日以内にイメージングする場合は、チップにPBSを充填したままにしてください。チップをイメージングの1日以上前に保管する場合は、チップが入った皿をパラフィンフィルムで包んで蒸発を防ぎ、イメージングの準備が整うまで4°Cで保管してください。
15. サンプルの長期保存には、封入剤(Fluoromount-Gなど)を使用することができます。
    1. チップのウェルからほとんどの液体を取り除きます。1 mLの使い捨てプラスチックピペットを使用して、軸索コンパートメントと体細胞コンパートメントの各上部ウェルに2滴の封入剤を追加します。
    2. チップを傾けて、封入剤がチャネルを通る流れを促進します。5分後、ボトムウェルに2滴加えます。1時間待ってからイメージング.
       手記： 封入剤を使用した後は、他の対象物を再プローブすることはできません。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
Xonaチップ	Xona Microfluidics, LLC	XC150	長さ150μmのマイクログルーブバリア
Xonaチップ	Xona Microfluidics, LLC	XC450	長さ450μmのマイクログルーブバリア
Xonaチップ	Xona Microfluidics, LLC	XC900	長さ900μmのマイクログルーブバリア
XCプレコート	Xona Microfluidics, LLC	XCプレコート	XonaChipsに含まれています
キソナPDL	Xona Microfluidics, LLC	キソナPDL
神経基礎媒体	サーモフィッシャーサイエンティフィック	21103049
ガラスパスツールピペット	シグマ・アルドリッチ	CLS7095D5Xシグマ
16%ホルムアルデヒドを突き刺	サーモフィッシャーサイエンティフィック	28906
PBSの(10倍)	サーモフィッシャーサイエンティフィック	QVC0508
正常なヤギの血清	サーモフィッシャーサイエンティフィック	16210064
トリトンX-100	サーモフィッシャーサイエンティフィック	28314
抗vGlut1抗体	ニューロマブ	75から066	クローンN28 / 9、1:100
Alexa Fluor二次抗体	サーモフィッシャーサイエンティフィック		17:40
スピニングディスク共焦点イメージングシステム	アンドールテクノロジー	CSU-X1、iXon X3 EMCCD	60xシリコーンオイルと20x対物レンズ