ラット皮質ニューロンにおける糸状アクチンプンクタの定量化

要約

出典:Li, H., et al.ラット皮質ニューロンにおける糸状アクチン(F-アクチン)点の定量化。J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオは、顕微鏡検査のためにラット皮質ニューロンを蛍光染色する手順を示しています。F-アクチンと樹状タンパク質を標的とし、構造的完全性を解析し、神経細胞の機能と健康を研究するために重要なF-アクチン密度を計算します。

プロトコル

1. 蛍光標識と免疫細胞化学

>注:初代皮質細胞培養物の免疫蛍光標識は、ガラス底の35 mm細胞培養皿で1 mlの作業容量で実施しました。

1. ガラス底皿をリン酸緩衝生理食塩水pH7.4(PBS)で2回洗います。
2. 細胞を4%パラホルムアルデヒドで室温(RT)で15分間固定します。
3. 細胞をPBSで2回洗浄し、0.1% Triton X-100をPBS溶液で5分間透過処理します。
4. 細胞を室温で20分間処理し、F(糸状)-アクチン特異的染色剤であるAlexaFluor 488 Phalloidin(1:40、PBS1 mLに25 μlのファロイジンを含ませてください)を添加します。
5. 細胞をPBSで2回すすぎ、RTで10%正常ヤギ血清で1〜2時間ブロックします。
6. ニワトリポリクローナル抗MAP2(微小管関連タンパク質2)抗体(1:2,500)をPBSで2%正常ヤギ血清で希釈し、O / Nを4 ⁰°Cで(一晩)インキュベートします。
7. インキュベーション後、PBSで2回すすいでください。
8. 二次抗体(Alexa Red 594-conjugated goat anti-chicken IgG (1:500))を2%正常ヤギ血清で希釈し、RTで2時間インキュベートします。
9. PBSですすぎ、1皿あたり10 μlのHoescht染料を加えます。
10. 室温で3分間インキュベートし、PBSで2回洗浄します.
    手記：これで、標識された細胞はステップ2(F-actin puncta counting)の準備が整いました。
11. 細胞サンプルを100 μlの退色防止剤で保存し、暗所で4 ⁰°Cに保って長期保存します。
    手記： ファロイジンは、+4°Cの暗所で最大1週間のPBSで比較的安定しており、蛍光は退色防止剤のカバースリップ試薬で保存することができます。ただし、ファロイジンは長期保存により拡散し始める可能性があるため、染色後1〜3日で最適な画像が得られます。

2. F-actin プンクタカウンティング

1. 蛍光顕微鏡の電源を入れ、対物レンズを20×に切り替えます。顕微鏡ソフトウェアを開き、1280×960ピクセルの画像サイズと1×ズームで0.17μm/ピクセルの画像解像度でプログラムを設定します。
2. 緑色(495 nm)または赤色(613 nm)の蛍光チャネルで共標識されたF-actin/MAP2ニューロンの画像を取得します。
3. 明確に定義された樹状突起を持つ個々のニューロンの5つの緑(F-アクチン)/赤(MAP2)免疫標識/青(Hoescht)蛍光画像を選択します。
4. 連続的なMAP2免疫蛍光法により、二次樹状突起セグメント(長さ範囲25-75μm)のF-アクチンリッチ構造を同定します。
5. 選択した画像の領域を水平方向に回転します。コピーして新しい画像として貼り付けます。
6. 画像の背景を差し引くには、各料理に一貫した調整を使用します。
7. 明るい緑色のF-アクチン点を数え、訓練を受けた独立した観察者が手動で選択した樹状突起セグメントの長さをトレースします。データをスプレッドシート ファイルにエクスポートします。
8. F-アクチンで標識されたpuncta(N)の合計をMAP2で標識された樹状突起の長さ(L)で割って密度を計算します。10 μmの樹状突起あたりのF-アクチン点の数としてデータを表現
   手記：樹状突起シャフトの染色の平均強度を少なくとも50%上回るピーク強度を持つF-アクチン蛍光の点状(サイズ≤1.5μm)を、選択した各樹状突起セグメントに含めました。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
35mmガラス底皿1.5号カバーガラス	MatTek株式会社	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 ミディアム	ライフテクノロジー	〒10565-018
ポリ-L-リジン	シグマ	P9155
パラホルムアルデヒド	シグマ	P6148
AlexaFluor 488ファロイジン	ライフテクノロジー	A12379 (英語)
通常の馬の血清	ライフテクノロジー	26050-070
チキンポリクローナル抗MAP2	アブカム	AB92434
アレクサレッド594結合ヤギ抗チキンIgG	ライフテクノロジー	A11042 (英語)
NucBlue 生細胞染色試薬 ReadyProbes 試薬 Hoescht 33342	ライフテクノロジー	R37605
NIS-Elements ソフトウェアパッケージ	ニコンインスツルメンツ
ニコン エクリプス TE2000-E 倒立蛍光顕微鏡	ニコンインスツルメンツ

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