ラットの緑内障誘発のための高張生理食塩水注射法

要約

出典:Gossman, C. A. et al. In Vivoラットモデルにおける緑内障誘発法および全マウント網膜調製。J. Vis. Exp.(2016年)

このビデオは、麻酔をかけたラットで高張生理食塩水を強膜上静脈に注入することにより、緑内障誘発を示しています。生理食塩水はシュレム管を介して海綿網に入り、組織の瘢痕化を引き起こし、房水の流出をブロックし、眼圧を上昇させます。圧力の上昇は網膜神経節細胞に損傷を与え、緑内障を引き起こします。

プロトコル

動物モデルを含むすべての手順は、地元の施設動物管理委員会とJoVE獣医審査委員会によって審査されています。

>1. 動物

1. この研究では、生後3か月の雄と雌のラットを使用します。
2. 動物を12時間の明暗サイクルに保ち、餌と水に無料でアクセスできます。

2. 動物麻酔用のKAX(ケタミン+キシラジン+アセプロマジン)カクテルの調製

1. キシラジン50 mg(20 mg / ml)を5 mlケタミン(100 mg / ml)に1 mlのアセプロマジン(10 mg / ml)と3 mlの蒸留水で溶解します。.よく混ぜます。
2. シリンジフィルターで滅菌し、この溶液を10mlの血清ボトルに保存します。

3. KAXインジェクション

1. 動物の体重(g)を量り、注射の準備ができるまでケージに戻します。
2. 28 Gの針が付いた1 mlのインスリン注射器を使用して、0.1 ml KAX / 100 gの動物の体重を腹腔内に注射します。.
3. 動物が意識を失うのを許してください。足と尻尾をつまんで反射神経を確認します。
4. 手術中は、すべての動物を実験室で安全に保管してください。
5. 手術後、動物をケージに入れ替え、意識が回復するまで室温(RT)で快適に過ごします。動物が目覚めて正常な行動に戻ったときにのみ、動物を動物施設に戻してください。

>4. 手術の準備とマイクロニードルの組み立て

1. 滅菌済みの2 M NaCl溶液を調製します。
2. 微小電極プーラー(図1C)を使用して、内径0.86 mmの重く研磨された標準および薄肉のホウケイ酸チューブ1本を、2本の細かく先細りのガラスマイクロニードル(図1D、図1E)に引き込みます。
3. 前のステップで採取した1本のマイクロニードルを、バックフィルシリンジニードルと1 mLシリンジを使用して、2 M生理食塩水で埋め戻します(図1B)。電極の先端から気泡を引き出します。
4. 2つ目の1 mlシリンジに2 M NaClを入れます。18 Gの針を接続してから、長さ(約10インチ)のポリエチレンチューブを取り付けます(図1A)。シリンジプランジャーを使用して、針を通してポリエチレンチューブに生理食塩水を充填します。
5. マイクロニードルとチューブの両方に生理食塩水が充填されたら、2つを慎重に接続します。それらの間の接続部の空気をすべて取り除きます(図2)。
6. マイクロニードルの先端をコースペーパータオルの木目に非常に軽くこすりつけて、細かく面取りします。
7. ペーパータオルに液体の細かい流れが見えるまで、シリンジのプランジャーをそっと押して、マイクロニードルの抵抗を確認します。液体の流れは0.5mm以下の幅でなければなりません。

5. 動物の調理法

1. 角膜に1〜2滴の局所麻酔薬を塗布します(プロパラカイン塩酸塩点眼液、USP、0.5%)。.眼反射がなくなるまで待ちます。.
2. はさみでひげをトリミングします。
3. 綿の先端アプリケーターをベタジン溶液で飽和させ、実験眼の周りを綿棒で拭きます。
4. 顕微鏡を使用して、止血器を取り付けて下まぶたをクランプして目を膨らませ、強膜上静脈を露出させ、眼球運動を制限します。(図3、矢印)

6. 緑内障を誘発する生理食塩水注射

1. マイクロニードルアセンブリと動物の準備ができたら、注射を開始します。
2. 足や尻尾のつまみに反応しないことが確認されたら、マイクロニードルで強膜上静脈を静脈に対して10度から20度の低角度で慎重に突き刺します(図3、白矢印)。静脈への穿刺が成功したことは、血液がマイクロニードルの先端に入ると明らかです(図3、黒矢印)。
3. 約50μlの生理食塩水をゆっくりと手動で静脈に注入します。これには約 10 秒かかります。塩が血管系を循環すると、静脈は白くなります(図4、矢印)。一部の領域では、血のように赤い外観が維持される場合があります(図4、矢印)。
   1. 最初の注射部位とは反対側の静脈に2回目の注射を行い、完全な網膜神経節細胞層への完全な網膜損傷を確実にします
      注:数分以内に、塩が血管系を循環するにつれて、目の虹彩を通してはっきりとした曇った外観が見えるはずです。
4. 反対側の目は、内部制御として使用するために未処理のままにしておきます。

結果

図 1.マイクロニードルコンポーネント。(ア)生理食塩水注射に使用したポリエチレンチューブ付きシリンジ (B)ホウケイ酸マイクロニードルの埋め戻しに使用したバックフィルシリンジ (C)ホウケイ酸マイクロニードルを作るためのナリシゲ電極プーラー (D)電極プーラーに引き込まれる前と引っ張られた後のホウケイ酸ガラス電極 (E)引っ張られた後の微小電極針先の拡大図。

図 2.完全なマイクロ...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
塩酸キシラジン、最小99%	シグマ、ライフサイエンス	X1251-1G
塩酸ケタミン注射剤、USP、100mg/ml	パットニー株式会社	NDCの26637-411-01	10mlボトル
アセプロマジンマレイン酸、10mg / ml	フェニックスファーマシューティカル株式会社	NDC 57319-447-04、670008L-03-0408	50mlボトル
美容液ボトル、10 ml	VWRの	16171319	ホウケイ酸ガラス
1mlインスリン注射器	VWRの	BD329410	28G針
塩化ナトリウム	シグマ	S7653	2 M ソリューション
微小電極プーラー	成茂グループ	PP-830
ヘビーポリッシュスタンダードおよび薄肉ホウケイ酸チューブ	サッターインストゥルメント	B150-86-10馬力	フィラメントなし、0.86 mm
マイクロピペットを充填するためのマイクロフィルシリンジ針	ワールド・プレシジョン・インスツルメンツ(株	MF28Gの
18ゲージルアーロックニードル	フィッシャーサイエンティフィック	1130421	シリンジ針
フレキシブルポリエチレンチューブ	フィッシャーサイエンティフィック	22046941	直径0.034インチ、約10インチ
プロパラカイン塩酸塩点眼液、USP、0.5%	アコーン株式会社	NDCの17478-263-12	15 ml滅菌ボトル
顕微鏡	ライカ	ステレオズーム4
止血クランプ	ファインサイエンスツール	1310912	カーブエッジ
トリプル抗生物質軟膏	フィッシャーサイエンティフィック	NC0664481
メスのハンドル	ファインサイエンスツール	10004-13
メスの刃 #11	ファインサイエンスツール	10011-00
60 mm x 15 mm使い捨てペトリ皿	VWRの	351007
リン酸緩衝生理食塩水 10x 濃縮液	シグマ、ライフサイエンス	P7059-1L	1倍希釈
春はさみ	ファインサイエンスツール	15009-08
鉗子(2)、デュモン#5	ファインサイエンスツール	11251から30
シルガード184	VWRの	102092-312