脳組織抽出物からのアミロイド線維の単離

要約

出典: Upadhyay, A. et al., Biochemical Purification and Proteomic Characterization of Amyloid Fibril Cores from the Brain. J. Vis. Exp. (2022)

このビデオでは、密度勾配遠心分離と非アミロイドタンパク質の消化を使用して、マウス脳組織抽出物からアミロイド線維を分離するプロトコルを示しています。

プロトコル

動物サンプルを含むすべての手順は、適切な動物倫理審査委員会によって審査され、承認されています。

1. 組織採取とアミロイド精製

>注:理想的には、アミロイド線維は新たに解剖された脳領域から分離されるべきです。ただし、この方法は、スナップ凍結または瞬間凍結した脳組織にも適しています。以下は、後で使用するために保存するためのスナップ凍結脳組織の概要です。

1. 脳組織の採取と保存:マウスの脳を解剖し、アミロイドを含む領域(皮質と海馬など)を迅速に採取した後、液体窒素またはドライアイスアルコール浴で急速凍結します
   手記：スナップフリーズは、組織の構成要素の構造特性を維持するのに役立ちます。マウスは、イソフルランと子宮頸部脱臼によって安楽死させられます。CO₂の使用は脳のプロテオームの完全性を損なう可能性があるため、使用を避けることをお勧めします。
2. 解剖後、新鮮な組織を小さなブロック(5 mm x 5 mmなど)に切断し、保存することで、アミロイド抽出前の効率的な均質化が容易になります。組織を滅菌極低温バイアルに移し、キャップを締めて、急速に沈めます。
3. 組織を極低温条件(-80°Cまたは液体窒素)で凍結してください。数日後に抽出を行う場合は、組織を-20°Cで保存し、凍結と融解のサイクルを避けてください。抽出と精製の準備ができたら、凍結したティッシュを湿った氷の上で解凍します.
   手記：組織が液体窒素と直接接触すると、組織やタンパク質が損傷する可能性があります。アルコール浴は、チューブラベルから油性マーカーを取り除くことができることに注意してください。

2. ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)不溶性物質の濃縮

>注:特に明記されていない限り、氷上ですべての手順を実行し、4°Cで遠心分離します。化学薬品および機器のメーカーおよびカタログ番号は、材料表に記載されています。

1. 解剖したばかりまたは急速凍結した脳組織領域(氷上で解凍)を、6〜8個のセラミックビーズと新たに調製した氷冷ホモジナイズバッファー(0.25〜1gの湿潤組織塊に対して1mL)を含む2mLチューブに入れることから始めます。
2. チューブをビーズミルホモジナイザーに移し、組織内容物を4000rpmで、それぞれ30秒の2サイクルと30秒の間隔で粉砕します
   手記： あるいは、電動スターラーまたはホモジナイザーシステムを使用して、組織を粉砕および均質化することもできます。
3. 15 mLチューブ中の1 mLの脳全組織ホモジネートに9 mLの氷冷ホモジナイズバッファーを加え、実験用ワックスフィルムストリップで密封し、4°Cで一晩中エンドツーエンドで回転させて、堅牢な可溶化を確保します。
   手記：不要な大きな細胞の破片や脂質を除去するには、翌朝、チューブを800 x g、4°Cで10分間回転させ、上清を新しいチューブに集めます。残りのペレットを氷冷ホモジナイゼーションバッファー2mLに再懸濁し、よく混合し、再度4°Cで10分間遠心し、2つの上清を混合します。
4. 組織抽出懸濁液に固体スクロースを最終濃度1.2 Mまでゆっくりと加え、よく混合し、250,000 x gで4°C、45分間遠心分離します。
5. ピペットを使用して上清を慎重に取り除き、廃棄します。1.9 Mスクロースを含む2 mLのホモジナイズバッファーにペレットを再懸濁してトリチュレートした後、125,000 x gで45分間、4°Cで遠心分離します
   手記：バッファ容量は、前のステップから回収された材料の量に基づいて調整できます。一般に、このステップには10容量の均質化バッファー(V / V)が理想的です。
6. ピペットを使用して上部の白色固体層を回収し、新しいチューブに移し、気泡を導入せずに数回ピペッティングして1mLの氷冷洗浄緩衝液に可溶化します。
7. 最上層とは別に、ペレットにはアミロイド線維も豊富に含まれています。より高い収率を得るには、2つのフラクションを組み合わせて続行します。ピペットを使用して中央の水性層を慎重に取り除き、廃棄します。
8. 結合した画分を8000 x gで4°Cで20分間遠心分離し、上清を捨てます。
9. 洗浄したペレットに氷冷消化バッファー1 mLを加え、再懸濁し、室温(RT)で3時間インキュベー
トします。
10. 8000 x gで4°Cで20分間遠心分離し、ピペットを使用して上清を除去します。
11. 消化したペレットを再懸濁し、1 mLの氷冷トリスバッファーで2回洗浄します(ステップ2.8と同じ)。
12. ピペッティングを上下させて、洗浄したペレットを1 mLの1 mLの1 mLの可溶化緩衝液に再懸濁します。200,000 x gで4°C.
    で60分間迅速に遠心分離します。 手記：アミロイド線維は界面活性剤や変性剤に対して高い耐性を持っていますが、界面活性剤(1% SDS)に非常に長時間さらされると、線維の完全性に影響を与えたり、密接に結合したタンパク質が除去されたりして、その後の分析に支障をきたす可能性があります。したがって、ペレットを再懸濁した直後に、遠心分離に進みます。
13. ペレットを保存し、50 mM Trisバッファー(比率1:0.3)を添加してショ糖濃度を1.3から1 Mに減らし、さらに200,000 x gで4°Cで45分間遠心分離することにより、残りの上清の量を増やします。
14. 2つのペレットを0.5%SDSを含む100μLのTrisバッファーに溶解し、アミロイド精製のためにプールします。目に見えるペレットは小さく、不透明でオフホワイトに見えるはずです(図1Aを参照)。

結果

図1:アミロイド線維の生化学的染色とイメージングによるアミロイド抽出の確認。(A)濃縮されたアミロイド含有SDS不溶性ペレットは、色が不透明でオフホワイトに見えます。(B)0.45μmニトロセルロース膜上にブロットされた精製アミロイドを含むSDS可溶性上清およびSDS不溶性ペレットのコンゴ赤色染色。BCA測定値は、タンパク質の負荷量の正規化に使用されました。BCAアッセイは、製造元の指示に従って実施されました。(C)コンゴ赤染色後のSDS可溶性およびアミロイド物質の明視野画像(スケールバー:100μm)。(D)電子顕微鏡(スケールバー:100nm)下でのネガティブ染色によるSDS可溶性画分および精製アミロイド線維の可視化。(E)...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
プロテアーゼインヒビト	サーモサイエンティフィック	164535	他のメーカーの代替機器、化学薬品、抗体を使用することができます
塩化カルシウム	シグマ・アルドリッチ	C1016	他のメーカーの代替機器、化学薬品、抗体を使用することができます
コラゲナーゼ	シグマ・アルドリッチ	C0130	他のメーカーの代替機器、化学薬品、抗体を使用することができます
コンプリートプロテアーゼ阻害剤カクテル	シグマ・アルドリッチ	11697498001	他のメーカーの代替機器、化学薬品、抗体を使用することができます
DNアーゼI	サーモフィッシャーサイエンティフィック	EN0521	他のメーカーの代替機器、化学薬品、抗体を使用することができます
K54組織均質化システムモーター	コール・パーマー	グラスコール099C	他のメーカーの代替機器、化学薬品、抗体を使用することができます
オプティマL-90K超遠心分離機	ベックマン・コールター	BR-8101P-E	他のメーカーの代替機器、化学薬品、抗体を使用することができます
Precellys 24組織ホモジナイザー	ベルタン・インストゥルメンツ	P000062-PEVO0-A	他のメーカーの代替機器、化学薬品、抗体を使用することができます
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)	シグマ・アルドリッチ	74255	他のメーカーの代替機器、化学薬品、抗体を使用することができます
Sorvall Legend Micro 21R 微量遠心分離機	サーモフィッシャーサイエンティフィック	75002446	他のメーカーの代替機器、化学薬品、抗体を使用することができます
トリス-HCl	サーモフィッシャーサイエンティフィック	15568025	他のメーカーの代替機器、化学薬品、抗体を使用することができます