新生児マウス脳におけるマウスサイトメガロウイルス分布を分析するための脳室内注射

要約

出典:Kawasaki, H., et al. Intracerebroventricular and intravascular Injection of Viral Particles and Fluorescent Microbeads into the Neonatal Brain. J. Vis. Exp. (2016).

このビデオは、新生児マウスの脳内のマウスサイトメガロウイルス(MCMV)の分布を研究するための脳室内注射プロセスを示しています。MCMVは、視認性を高めるために増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)を発現するように設計されており、マウスの子犬の脳の側脳室に注入されます。注入されたウイルスは脳脊髄液を循環し、辺縁帯、脈絡叢、脳室下帯などの脳室周囲領域の細胞に感染します。

プロトコル

1. 新生児マウスへのMCMVおよび蛍光マイクロビーズのICV注入

1. 正常な妊娠ICRマウスを温度管理された施設で12時間の明暗サイクルの下で維持します。新生児は、出生日にP 0.5と指定されています。
2. 10 μLのシリンジと27 Gの針を70%アルコールで滅菌します。
3. MCMVまたは蛍光マイクロビーズを含む注入液(5μl)をシリンジのプランジャーを慎重に引いて針にロードします。
4. 新生児マウス(P 0.5)を氷の上に3〜4分間置いて拘束します。動物が麻酔下に入ったら、つま先をつまむ反応法を使用して麻酔の深さを決定します。
矢
5. 状縫合糸の外側約0.7〜1.0 mm、新生児ブレグマから0.7〜1.0mm尾側の位置に、無毒の実験用ペンで注射部位をマークします(図1A)。
6. マークされた注射部位の頭蓋骨表面に対して垂直に、深さ2mmの針を挿入します。参考までに、針の先端から2mmのところに無毒のメーカーで印を付けます。
7. 頭皮を開かずに、5 μlのMCMV(約5 × 10⁵ PFU)を側心室にゆっくりと注入します(図1B)。
8. 別のマウス群に、蛍光マイクロビーズを含む5μL溶液(0.1〜0.3μm、約5.75×10粒⁸粒)を同様の方法で注入します。
9. プランジャーの動きを中止してから10〜20秒後に針をゆっくりと取り外して、逆流を防ぎます。
10. 回復するには、動きと一般的な反応性が回復するまで、マウスを温かい容器に5〜10分間保管します。
11. 注射後3、12、24、48、および72時間の範囲の時点で脳を採取します。

結果

図1:新生児マウスの注射部位。(A、B)5 μl MCMV (約 5 × 10⁵ PFU) または 5 μl マイクロビーズ (約 5.75 × 10⁹ 粒子) の ICV 注入。(A)注射部位は、耳と目の中間点(矢状縫合糸の外側約0.7〜1.0 mm、新生児ブレグマから尾側約0.7〜1.0mmの位置)にあります。(B)10μlシリンジ付きの27G針を使用して、頭蓋骨表面に垂直な深さ2mmの側脳室に注射します。(C、D)MCMVまたはマイクロビーズは、新生児マウスの側頭顔面静脈に注入されます。(C)トランスイルミネーター(静脈ファインダー)を使用して、表在性側頭(顔面)静脈を視覚化します。(D)35Gの針が付いた1ml...

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
SPHERO TM 蛍光ポリスチレン ナイルレッド 0.04-0.06	Spherotech, Inc. (スフェロテック)	FP-00556-2
SPHERO TM 蛍光ポリスチレン ナイルレッド 0.1-0.3	Spherotech, Inc. (スフェロテック)	FP-0256-2
SPHERO TM 蛍光ポリスチレン ナイル レッド 1.7-2.2	Spherotech, inc. (英語)	FP-2056-2
10%マウス血清	だこ	X0910
C57BL/6マウス	SLC株式会社
ICRマウス	SLC株式会社
変性マイクロリットルシリンジ(7000シリーズ)	ハミルトン社
35ゲージニードル	サイトウメディカル
pEGFP-N1ベクター	クロンテック	#6085-1