脳室周囲内皮細胞からの化学療法引力の手がかりに対する介在ニューロン応答の評価

要約

出典:Datta, D., et al. ヒト幹細胞由来内皮細胞およびGABA作動性ニューロンの移動、化学吸引、および共培養アッセイ。J. Vis. Exp.(2020年)。

このビデオは、脳室周囲内皮細胞(PVEC)からの化学療法引力の合図に応答してニューロン間移動をテストする方法を示しています。介在ニューロンは中央のコンパートメントに配置され、両側にPVECと制御細胞があります。PVECへの移動の増加は、それらの化学療法引力シグナルに対する肯定的な反応を示しています。

プロトコル

1. ケモ引力アッセイ

1. 滅菌ピンセットを使用して、ポリ-L-オルニチン/ラミニンでコーティングされた35 mmディッシュの中央に3ウェル培養インサートを置きます。
2. 皿を逆さまにします。インサートの中央コンパートメントの周りの境界を、先端が極細の黒の油性マーカーを使用してマークします。
3. 70 μLのニューロン培地中の中央コンパートメントに3 x 10⁴個のヒトGABA作動性介在ニューロンをシードします(図1A)。
4. 2つの外側コンパートメントにそれぞれ、70 μLの脳室周囲内皮細胞培地に10^μLのヒト脳室周囲内皮細胞を、70 μLのコントロール内皮細胞培地に10⁴個の制御内皮細胞をシードします(図1A)。
5. ディッシュの側面に沿って1 mLの共培養培地(GABAを含まない50%脳室維持培地と50%のニューロン培地)を加えて、ディッシュのコーティングが乾燥するのを防ぎます。
6. 顕微鏡でチェックして、細胞がインサートコンパートメントから漏れていないことを確認します。
7. 細胞を37°Cおよび5%CO₂で24時間インキュベートします。24時間のインキュベーション後、顕微鏡で細胞が適切に付着していること、および漏れがないことを確認します。
8. 播種の48時間後、滅菌ピンセットを使用してインサートを静かに取り出します。顕微鏡で細胞層が乱されていないことを確認します(0日目)。
9. 培地を取り出し、新鮮な共培養培地1mLを加えます><。 注:0日目の画像に必要な数の料理を確保します。
10. 細胞を37°Cおよび5%CO₂で36時間インキュベートします。36時間後、培地を吸引し、細胞を4%PFAで10分間固定し、1x PBSで3回洗浄します。
11. ヒトGABA作動性介在ニューロンを抗ヒト β-チューブリン抗体または抗ヒト MAP2 抗体で染色します。染色手順の最後に、各皿に1 mLの退色防止用封入剤を加えます。

2. イメージングとデータ解析

1. 免疫染色したアッセイディッシュを4倍の倍率で顕微鏡下に置きます。
2. 長方形の境界(上記の手順5.10で作成)の1つの長いエッジを視野内に保ちます。その境界に隣接するセルフリースペース内のセルの画像を撮ります。長方形の境界の右長辺と左長辺に沿って画像を取得します。
   注:長方形に対して対角線上に配置されたセルは、開始マークとして短辺または長辺を選択する際のあいまいさのため、考慮されません。また、短辺を横切って移動する細胞の数は、多くの場合、大幅に少なくなり(おそらく短辺に沿った開始細胞の数が少ないため)、考慮されません。
3. ImageJ で画像を開きます。ImageJ を使用して、各セルと境界マークの間の距離を計算します。
4. セル番号で移動を評価するには、ImageJ で取得した画像の境界から特定の距離を設定します。この距離内に存在するセルの数をカウントします。平均数、標準デビアを計算
5. tion、および適切なソフトウェアを使用した統計的有意性。

結果

図1:ケモ・アタクション・アッセイ。(A)ケモアトラクションアッセイのスキーマ。3ウェル培養インサートを使用して、介在ニューロン(IN)を中央(緑色の点線の長方形)に播種し、脳室周囲内皮細胞(PV EC;オレンジ色の点線の長方形)と制御内皮細胞(EC;黄色の点線の長方形)を両側に播種しました。(B)β-チューブリン標識介在ニューロンの画像は、脳室周囲内皮細胞への強力な移動を示していますが、制御内皮細胞への移動は示していません。(C)介在ニューロンの化学療法引力応答の定量化。脳室周囲内皮細胞に向かって移動したニューロンの数は、制御内皮細胞よりも有意に多かった。データは平均± S.D.(n = 5; *p < 0.05、スチューデントのt検定)を表します。スケールバー = 100 μm。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ヒト内皮細胞の制御	細胞ダイナミクス	R1022
コントロール内皮細胞培地サプリメント	細胞ダイナミクス	M1019
DMEMF/12 ミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	11320033
E6 ミディアム	サーモフィッシャーサイエンティフィック	A1516401
FGF2	サーモフィッシャーサイエンティフィック	PHG0261
フィブロネクチン	サーモフィッシャーサイエンティフィック	33016-015
ギャバ	シグマ・アルドリッチ	A2129の
血球計算盤	シグマ・アルドリッチ	Z359629
ヒトGABA作動性ニューロン	細胞ダイナミクス	R1013
ヒトGABA作動性ニューロンベース培地	細胞ダイナミクス	M1010
ヒトGABA作動性ニューロン神経サプリメント	細胞ダイナミクス	M1032
ラミニン	シグマ	L2020
封入媒体	ベクターラボ	H-1200
ポリ-L-オルニチン	シグマ	P4957
PBSの	サーモフィッシャーサイエンティフィック	14190
ベグフ-A	ペプロテック	100-20
VascuLife VEGF ミディアムコンプリートキット	ライフラインセル技術	LL-0003	コントロールヒト内皮細胞培地の成分
3ウェルシリコーン培養インサート	同上	80369
35mmディッシュ	コーニング	430165
4% PFA溶液	フィッシャーサイエンティフィック	AAJ19943K2
倒立位相差顕微鏡	ツァイス	ツァイスアクシオバート40C
蛍光顕微鏡	オリンポス	FSX-100
抗ヒトβ-チューブリン抗体	バイオレジェンド	802001
抗MAP2抗体	ニューロミクス	CH22103