方法論記事

運動ニューロンライセートからの標的タンパク質-DNA複合体の免疫沈降

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2025年7月8日

この記事について

要約

出典: Montanera, K. N. et al., Rhee, H. S. High-Resolution Mapping of Protein-DNA Interactions in Mouse Stem Cell-Derived Neurons using Chromatin Immunoprecipitation-Exonuclease (ChIP-Exo). J. Vis. Exp. (2020)

このビデオは、標的タンパク質特異的抗体被覆磁気ビーズを使用して、幹細胞由来の運動ニューロンライセートから標的タンパク質と架橋されたDNA断片の免疫沈降を示しています。

プロトコル

>注:オートクレーブ蒸留水および脱イオン水(ddH2O)は、バッファーおよび反応マスターミックスの作成に推奨されます。

1. セルの収集とクロスリンク

  1. マウス胚性幹細胞(ES)細胞を有糸分裂後ニューロンに分化させた後、採取した細胞に11%のホルムアルデヒドを添加し、最終濃度を1%(v/v)にします。ロッキングプラットフォーム(ロッカー、シェーカー、またはローテーター)上の岩石細胞を室温(RT、25°C)で15分間<> 手記：架橋する標的タンパク質に応じて、ホルムアルデヒドの架橋が少ない(例えば、最終濃度が0.5%)か、グルタル酸ジスクシンイミジル(DSG)との二重架橋を使用することができます。
  2. 2.5 Mグリシンを最終濃度150 mMまで添加して、架橋反応を停止します。RTのロッキングプラットフォーム上のロックセルを5分間。
  3. 15 mLコニカルチューブ内の架橋細胞をRTで6分間、1,350 x gで遠心分離します。溶液を吸引し、細胞を5 mLの1xリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に再懸濁します
    手記：架橋された細胞ペレットは、液体窒素で急速凍結した後、-80°Cで保存できます。

2. 細胞溶解

>注:このプロトコルの次のステップは、マウスES細胞から分化した約2×107ニューロン細胞用です。オープンセルを切断するために、さまざまな界面活性剤を含む溶解バッファーが使用されます。使用直前に、50 mLのバッファーに50 μLの1000倍完全プロテアーゼ阻害剤(CPI)ストックを添加します。

  1. 表1に記載されているように、溶解バッファー1-3を調製します。
  2. 架橋細胞ペレットを氷上で解凍し、細胞ペレットを3 mLの溶解バッファー1 in 15 mLコニカルチューブに完全に再懸濁します。ロッキングプラットフォーム上で4°Cで15分間岩を打つ。1,350 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引します。
  3. ペレット化した細胞を3 mLの溶解緩衝液2に完全に再懸濁します。ロッキングプラットフォームの上で4°Cで10分間ロックします。1,350 x gで4°Cで5分間遠心分離し、上清を吸引します。
  4. 各ペレットに1 mLの溶解バッファー3を加え、氷上に保管します。すぐに超音波処理に進みます。

3. クロマチンの超音波処理

>注:この超音波処理手順中は、クロスリンクの反転を減らすために、サンプルを氷上または4°Cに保管してください。

  1. 滅菌ヘラを使用して、15mLポリスチレンチューブに0.2mLの目盛りまで超音波処理ビーズ(材料の表)を追加します。乾燥した斑点が見えなくなるまで、600μLの1x PBSでボルテックスして超音波処理ビーズを洗浄します。チューブを30 x gで5秒間遠心分離し、1x PBS.
    を吸引します。 手記：ポリスチレンチューブでの超音波処理は、ポリプロピレンチューブでの超音波処理よりも効率的です。超音波処理する細胞の数が少ない場合(例えば、<106細胞)は、超音波処理ビーズを添加せずに1.5mLのポリスチレンチューブを使用してください。
  2. 核溶解物を1mLの溶解緩衝液3(ステップ2.4から)に完全に再懸濁し、次いで超音波処理ビーズを含む15mLポリスチレンチューブに移す。ポリスチレンチューブを短時間ボルテックスします。
  3. 架橋クロマチンDNAを断片化するには、核溶解物を4°Cで最適なサイクル数で超音波処理し、電力振幅を30 Wに設定し、超音波処理サイクルを30 s on/30 s offに設定します
    手記：各細胞タイプおよびバッチに対する超音波処理の最適化により、最高のクロマチン免疫沈降-エキソヌクレアーゼ(ChIP-exo)収量が得られます。2 x 107マウスニューロン細胞の場合、上記の設定で20-30回の超音波処理サイクルにより、クロマチンが100-500 bpの範囲で断片化されます。
  4. 超音波処理が完了したら、各サンプルからすべての上清(超音波処理された溶解物)を1.5mLチューブに移します。最終濃度1%で各サンプルに10%の2-[4-(2,4,4-トリメチルペンタン-2-イル)フェノキシ]エタノール)を添加します。ピペッティングで混合します。
  5. 細胞破片をペレット化するために、サンプルを13,500 x gで4°Cで10分間遠心分離し、各サンプルからすべての超音波処理されたライセート(上清)を新しい1.5 mLチューブに移します。
  6. 各サンプルから30 μLの超音波処理ライセート(超音波処理ライセートの~3%)を取り出し、新しい1.5 mLチューブに加えて超音波処理を確認します。残りの超音波処理ライセートは、抗体コーティングビーズとのインキュベーションの準備ができるまで4°Cで保存してください。

4. 超音波処理の確認

  1. 2 mLの0.5 M Tris-HCl(pH 8.0)、2 mLの0.5 Mエチレンジアミン四酢酸(EDTA)、10 mLの10%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、および6 mLのオートクレーブ滅菌ddH2Oを加えて、2x Proteinase K緩衝液20 mLを調製します。このバッファーに CPI を追加しないでください。RTで50mLチューブに保管します。
  2. タンパク質-DNA架橋を逆転させるには、タンパク質を除去して、各サンプルから30μLの超音波処理クロマチンを採取し(ステップ3.6から)、オートクレーブ処理したddH2O166μL、2xプロテイナーゼKバッファー200μL、および20mg/mLプロテイナーゼK4μLを添加します。
  3. 注:超音波処理されたライセートは、65°Cで一晩逆架橋することができます。
  4. フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(PCIA:25:24:1)とエタノール沈殿法を用いて、以下のようにDNAを抽出します
    注意：PCIAは有毒です。標準の個人用保護具(PPE)を装着したドラフトの下で使用してください。
    1. 1.5 mLチューブ中の各サンプルに400 μLのPCIAを加え、ボルテックスを最大速度に設定し、サンプルを20秒間ボルテックスします。18,400 x gでRTで6分間遠心分離します。2つのフェーズが観察されます。各サンプルの上部水層(透明相)を新しい1.5 mLチューブに慎重に移します。
    2. 10 mg/mL RNase Aを1 μL加え、サンプルを37°Cで30分間インキュベー
      3. トします。
    3. 各サンプルに 1 μL の 20 mg/mL グリコーゲンを添加し、氷冷した 100% エタノール 1 mL (-20 °C 冷凍庫で保存) で沈殿させます。短時間混合した後、サンプルを-80°Cの冷凍庫で30分から1時間インキュベートします。18,400 x gで4°Cで10分間サンプルを遠心分離し、100%エタノールを慎重に注ぎ出します。
    4. ペレットを氷冷した70%エタノール500μL(-20°C冷凍庫で保存)で洗浄します。18,400 x gで4°Cで5分間遠心分離し、70%エタノールを慎重に注ぎます。
    5. 1.5 mLチューブ内でサンプルを50°Cでインキュベートし、残りのエタノールが蒸発するまでインキュベートします。DNAペレットを15 μLのオートクレーブ滅菌済みddH2OまたはヌクレアーゼフリーのddH2Oに再懸濁します。
    6. 抽出したDNAサンプルをDNAラダーとともに、120-180Vの1.5%アガロースゲルで分析し、超音波処理したDNAのサイズを確認します。

>5. ビーズによる抗体インキュベーション

>注:このプロトコルの次のステップは、マウスES細胞から分化した約2×107ニューロン細胞用です。ChIP-exoプロトコルのどの時点でも磁気ビーズを凍結および解凍しないでください。ビーズに亀裂が入り、サンプルが汚染されたり、抗体の性能が損なわれたりする可能性があるためです。

  1. 細胞溶解および超音波処理後、ChIP用のProtein G磁気ビーズ(材料表)を調製し、磁気ビーズが均一になるまで混合し、25 μLの磁気ビーズを2 mLのタンパク質低結合チューブに加えます><。 注:使用する磁気ビーズの種類は、抗体の種類によって異なります。
  2. ビーズを1 mLのブロッキング溶液(表1)で洗浄し、よく混合した後、磁気ラックに1分間置きます。磁気ラックにまだ乗ったまま、上清が透明になったら取り除きます。
  3. 磁気ビーズにブロッキング溶液1mLを加えます。ロッキングプラットフォーム上で4°Cで10分間ロックチューブを固定します。短時間回転させてから、チューブを磁気ラックに置き、上清を取り除きます。
  4. 手順5.3をさらに2回繰り返します。
  5. 500 μLのブロッキング溶液を磁気ビーズに加えます。Isl1に対する抗体を短時間遠心し(0.04 μg/μL、材料表)、ブロッキング溶液中の磁気ビーズを含む対応する2 mLタンパク質低結合チューブに4 μgの抗体を加えます。
  6. ステップ5.5を抗体なしで繰り返します(つまり、ChIPの抗体コントロールなし).
    手記：添加する抗体の量は、抗体の品質やChIPに使用する細胞数を考慮することで、経験的に決定することができます。
  7. 岩石サンプルを4°Cで6〜24時間、ロッキングプラットフォーム上で
    8. 観察します。

6. クロマチン免疫沈降法(ChIP)

  1. ステップ5.8で得られた抗体コーティングビーズを1 mLのブロッキング溶液で洗浄します。4°Cのロッキングプラットフォームにサンプルを5分間置き、上清を取り除きます。
  2. 手順 6.1 をさらに 2 回繰り返します。
  3. 抗体コーティングビーズを50 μLのブロッキング溶液に再懸濁し、新しい2 mLタンパク質低結合チューブに移します。各ChIPサンプルについて、超音波処理したライセート(ステップ3.6から~1.0 mL)を2 mLのタンパク質低結合チューブ内の抗体被覆ビーズに加えます。
  4. 各サンプルをロッキングプラットフォーム上で4°Cで一晩インキュベートします。

7. ChIPが洗浄します

>注:ChIP洗浄中にタンパク質-DNA架橋を維持するために、サンプルを氷上または4°Cに保管してください。

  1. 表2に記載されているように、高塩分洗浄緩衝液、LiCl洗浄緩衝液、および10 mM Tris-HCl緩衝液(pH 7.4)を調製します。50 mLチューブに4°Cで保存し、使用直前に1000倍CPIストック50 μLをすべてのバッファーに加えます。
  2. 2 mLのタンパク質低結合チューブでサンプルを短時間遠心してキャップから液体を回収し、磁気ラックに1分間置き、ピペットで上清を慎重に取り除きます。
  3. ChIP洗浄の場合は、各チューブに1 mLの溶解バッファー3(4°C)を加えます。ロッキングプラットフォームで4°Cで5分間混合します。サンプルを短時間回転させた後、磁気ラックに1分間置き、ピペットで上清を取り除きます。
  4. 各チューブに1 mLの冷たくした高塩分洗浄バッファーを加えます。ロッキングプラットフォームで4°Cで5分間混合します。サンプルを短時間回転させた後、磁気ラックに1分間置き、ピペットで上清を取り除きます。
  5. 各チューブに1 mLの冷たいLiCl洗浄バッファーを加えます。ロッキングプラットフォームで4°Cで5分間混合します。サンプルを短時間回転させた後、磁気ラックに1分間置き、ピペットで上清を取り除きます。
  6. 各チューブに1 mLの冷たい10 mM Tris-HClバッファー(pH 7.4)を加えます。ロッキングプラットフォームで4°Cで5分間混合します。サンプルを短時間遠心した後、磁気ラックに1分間置き、ピペットで上清を取り除きます.
    手記：Tris-HClバッファー(pH 7.4)の代わりにTris-EDTAバッファー(pH 8.0)を使用できます。

表1:溶解バッファ1−3とブロッキングバッファのレシピ。50 mLチューブに4°Cで保存し、使用直前に1000x CPI(完全プロテアーゼ阻害剤)ストック50 μLをすべてのバッファーに加えます。

名 す す す
Lysisバッファ1
試薬内容量(mL)【最終版】
1 M HEPES (pH 7.3)2.550 mM
5 M NaCl1.4140 mM
0.5 M EDTA(pH 8.0)0.11 mM
50%グリセロール1010%
10%オクチルフェノールエトキシレート2.50.50パーセント
10% 2-[4-(2,4,4-トリメチルペンタン-2-イル)フェノキシ]エタノール1.250.25パーセント
オートクレーブ ddH2O50まで塗りつぶ
Lysisバッファ2
試薬内容量(mL)【最終版】
0.5 M Tris-HCl(pH 8.0)110 mM
5 M NaCl2200 mM
0.5 M EDTA(pH 8.0)0.11 mM
オートクレーブ ddH2O50まで塗りつぶ
Lysisバッファ3
試薬内容量(mL)【最終版】
1 M Tris-HCl(pH 8.0)0.510 mM
5 M NaCl1100 mM
0.5 M EDTA(pH 8.0)0.11 mM
10%デオキシコール酸0.50.10パーセント
30% N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩溶液0.830.50パーセント
オートクレーブ ddH2O50まで塗りつぶ
ブロッキングソリューション
試薬量【最終版】
ウシ血清アルブミン(BSA)250ミリグラム0.50パーセント
完全プロテアーゼ阻害剤 (CPI, 1000x)50 μL1倍
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)50mLまで充填します

表2:ChIP洗浄のレシピ:高塩分洗浄バッファー、LiCl洗浄バッファー、および10 mM Tris-HClバッファー(pH 7.4)。50 mLチューブに4°Cで保存し、使用直前に1000倍CPIストック50 μLをすべてのバッファーに加えます。

す す す
高塩ウォッシュバッファー
試薬内容量(mL)【最終版】
1 M HEPES (pH 7.3)2.550 mM
5 M NaCl5500 mM
0.5 M EDTA(pH 8.0)0.11 mM
10% 2-[4-(2,4,4-トリメチルペンタン-2-イル)フェノキシ]エタノール51%
5%デオキシコール酸10.10パーセント
5% SDS (英語)10.10パーセント
オートクレーブ ddH2O50まで塗りつぶ
LiCl洗浄バッファー
試薬内容量(mL)【最終版】
0.5 M Tris-HCl(pH 8.0)220 mM
0.5 M EDTA(pH 8.0)0.11 mM
1 M LiCl12.5250 mM
10%オクチルフェノールエトキシレート2.50.50パーセント
5%デオキシコール酸50.50パーセント
オートクレーブ ddH2O50まで塗りつぶ
10 mM Tris-HCl バッファー
試薬内容量(mL)【最終版】
1 M Tris-HCl(pH 7.4)0.510 mM
オートクレーブ ddH2O50まで塗りつぶ

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開示事項

利益相反は宣言されていません。

材料

この記事で使用された材料の一覧
名前会社カタログ番号コメント
アガロース、ウルトラピュアインビトゲン16500超音波処理の確認(セクション4.3.6)
アルブミン、ウシ血清(BSA)、プロテアーゼフリー、熱ショックアイソレーション、最低98%バイオショップALB003ブロッキングソリューション
Isl1に対する抗体DSHBの39.3F7ビーズによる抗体注入(セクション5.6)
バイオラプターピコダイアゲノードB01060010クロマチンの超音波処理(セクション3.3)
遠心分離機 5424 Rエッペンドルフ5404000138クロマチンの超音波処理(セクション3.5)、超音波処理の確認(セクション4.3.1、4.3.3および4.3.4)
遠心分離機 5804 Rエッペンドルフ22623508細胞の採取、架橋および凍結(セクション1.3)、細胞溶解(セクション2.2および2.3)、クロマチンの超音波処理(セクション3.1)
EDTAフリーの完全ミニプロテアーゼ阻害剤カクテルロシュ4693159001Proteinase KバッファーおよびChIP Elutionバッファーを除くすべてのバッファーに添加
デオキシコール酸ナトリウム塩フィッシャーサイエンティフィックBP349Lysis Buffer 3、High Salt Wash Buffer、LiCl Wash Buffer(リシスバッファー3、高塩ウォッシュバッファー、LiClウォッシュバッファー)
EDTA、0.5 m、滅菌溶液、pH 8.0バイオショップEDT111溶解バッファー1-3、超音波処理のチェック(セクション4.1)、高塩洗浄バッファー、LiCl洗浄バッファー、ChIP溶出バッファー
エチルアルコール無水、100%市販のアルコールP006EAAN超音波処理の確認(セクション4.3.3)
ホルムアルデヒド、36.5-38%、10-15%のメタノールを含むシグマF8775細胞の採取、架橋、凍結(セクション1.1)
グリセロール、試薬グレード、最小99.5%バイオショップGLY002溶解バッファー1
グリシン、バイオテクノロジーグレード、99%以上バイオショップGLN001細胞の採取、架橋、凍結(セクション1.2)
グリコーゲン、RNAグレードサーモサイエンティフィックR0551超音波処理の確認(セクション4.3.3)
HEPES、1 M 滅菌ろ過溶液、pH 7.3バイオショップHEP003Lysis Buffer 1、High Salt Wash Buffer(高塩洗浄バッファー)
塩化リチウム(LiCl)、試薬グレードバイオショップLIT704LiClウォッシュバッファー
ChIP(Dynabeads Protein G)用磁気ビーズDynabeads Protein G(ChIP用磁気ビーズ)Dynabeads Protein G(ChIP用磁気ビーズ)ビーズによる抗体インキュベーション(セクション5)
マグネットラック(DynaMag-2マグネット)インビトゲン12321Dさんセクション: 5 の多くのステップで使用されます
N-ラウロイルサルコシンナトリウム塩溶液、30%水溶液、≥97.0%(HPLC)シグマ61747溶解バッファー3
オクチルフェノールエトキシレート(IGEPAL CA630)バイオショップNON999Lysis Buffer 1およびLiCl Wash Buffer
フェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール、バイオテクノロジーグレード(25:24:1)バイオショップPHE512超音波処理の確認(セクション4.3.1)
リン酸緩衝生理食塩水(PBS)、1xコーニング21040履歴書細胞の採取、架橋および凍結(セクション1.3)およびクロマチンの超音波処理(セクション3.1)、ビーズによる抗体注入(セクション5.1)
PowerPac 基本電源バイオラッド1645050超音波処理の確認(セクション4.3.6)
プロテイナーゼK溶液、RNAグレードインビトゲン25530049超音波処理の確認(セクション4.2)
Rnase A、Dnase、プロテアーゼフリーサーモサイエンティフィックEN0531超音波処理の確認(セクション4.3.2)
塩化ナトリウム(NaCl)、バイオ試薬シグマS5886Lysis Buffer 1-3、High Salt Wash Buffer(高塩ウォッシュバッファー)
ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、電気泳動グレードバイオショップSDS001超音波処理(セクション4.1)、高塩洗浄バッファーおよびChIP溶出バッファーのチェック
超音波処理ビーズと15mLバイオラプターチューブダイアゲノードC01020031クロマチンの超音波処理(セクション3.1および3.2)
サーモミキサーF1.5エッペンドルフ5384000020セクション 4.2、4.3.2、および 4.3.5
Trizma塩酸塩溶液(Tris-HCl)、BioPerformance認証、1 M、pH 7.4シグマT219410 mM Tris-HCl バッファー
Trizma塩酸塩溶液(Tris-HCl)、BioPerformance認証、1 M、pH 8.0シグマT2694Lysis Buffer 2、Lysis Buffer 3、Checking Sonication(セクション4.1)、LiCl Wash BufferおよびChIP Elution Buffer
VWRミニチューブロッカー、可変速VWRの10159-752セクション 1、2、5、6、7 の多くのステップで使用されます
2-[4-(2,4,4-トリメチルペンタン-2-イル)フェノキシ]エタノール、トリトンX-100、試薬グレードバイオショップTRX506溶解バッファー1、クロマチンの超音波処理(セクション3.4)および高塩洗浄バッファー
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