小脳オルガノイドスライスの蛍光免疫染色

要約

出典: Silva, T. P., et al., Scalable Generation of Mature Cerebellar Organoids from Human Pluripotent Stem Cells and Characterization by Immunostaining. J. Vis. Exp. (2020年)

このビデオは、オルガノイドの成熟を示す様々な小脳ニューロンで発現する特定の標的抗原を特定するための小脳オルガノイドスライスの免疫蛍光染色を示しています。

プロトコル

1. オルガノイドスライスの免疫染色

1. オルガノイド切片を含む顕微鏡スライドを、予熱した1x PBSを50 mLのコプリングジャーに入れ、最大10枚のスライドを連続して保持します><。 手記： すべてのオルガノイド切片は液体に浸す必要があります。
2. 37°Cで45分間インキュベートし、スライドを糊ゼ化します。
3. RTで50 mLの1× PBSを5分間1回洗浄します:スライドを新鮮な1×PBSが入ったコプリングジャーに移します。
4. スライドを50 mLの新たに調製したグリシン(表1)が入ったコプリングジャーに移し、室温で10分間インキュベー
トします。
5. スライドを50 mLの0.1%トリトン(表1)が入ったコプリングジャーに移し、RTで10分間透過処理します。
6. 1×PBSで5分間2回洗浄します。
7. 1×PBSに浸した3mmの紙で免疫染色皿を調製します。スライスの周りをティッシュでスライドを乾かし、3mmの紙の上に置きます。パスツールピペットを使用して、スライドの全面をブロッキング溶液(表1)で覆います(スライドあたり0.5 mL)。室温で30分間インキュベートします。
8. 余分なブロッキング溶液を取り除き、スライスの周り全体をティッシュでスライドを乾燥させます。ブロッキング溶液で希釈した一次抗体50 μL (表2) を切片の上に置き、カバースリップで覆います。スライスを事前に準備した免疫染色皿に入れます。4°Cで一晩インキュベートします。
9. スライドを50 mLのTBSTを入れたコプリングジャーに移し(表1)、カバーガラスを落下させ、TBSTで5分間3回洗浄します。
10. ブロッキング溶液で希釈した二次抗体50 μLを切片の上に置き、カバーガラスで覆います。スライスを事前に準備した免疫染色皿に入れます。光から保護して、室温で30分間インキュベートします。
11. スライドを再びコプリングジャーに移し、TBST50mLで5分間3回洗浄します。
12. スライスの周囲にティッシュでスライドを乾燥させ、事前に準備した免疫染色皿にスライスを置きます。パスツールピペットを使用して、スライドの全面に0.5 mLのDAPI溶液を加えます。RTで5分間インキュベートします。
13. 手順1.9を繰り返します。
14. スライドをティッシュで慎重に乾かします。スライドに沿って50 μLの埋込用メディウムを一滴ずつ加え、カバースリップを各スライドに慎重に下げ、気泡を避けるためにわずかに曲げます。

>表1:凍結切片および免疫染色用のオルガノイド調製用溶液。 凍結切片および免疫染色用のオルガノイドの調製に使用される溶液の調製に使用されたすべての成分と容量がリストされています。

トします

ゼラチン/ショ糖 最終濃度:7.5%/ 15%w / w / w	1. 15 gのスクロースと7.5 gのゼラチンを滅菌ショットガラス瓶に入れ、よく混ぜ 2. PBS 1xを65°C で予温します 3.予熱したPBS 1xを最終重量100 gに加え、よく混ぜます 4. ショットガラスボトルを65°Cの加熱プレートに入れ、ゼラチンが溶けるまで振 5. 溶液が安定するまで37°Cでインキュベー
グリシン 最終濃度:0.1 M	0.37 gのグリシンを50 mLの新しく調製したPBS 1xに加えます。.
Tritonソリューション 最終濃度:0.1%w / v	1. 10 % Triton X-100 ストックを調製します: 5 g の Triton X-100 を 50 mL の PBS 1x に溶かします。 2. 0.5 mLのTriton X-100ストックを50 mLのPBS 1xに加えます。
TBST 20 mM Tris-HCl pH 8.0、150 mM NaCl、0.05 % w/v Tween-20	20 mL トリス 1 M 30 mL NaCl 5 M 5 mL Tween-20 (10 % ストック: 50 mL 水に 5 g の Tween-20) 1Lに水を入れます。
ブロッキングソリューション	TBST50 mLにウシ胎児血清(FBS、最終濃度:10 % v/v)を5 mL加えます。
DAPIソリューション	15 μL の DAPI ストック溶液 (1 mg/mL) を 10 mL の蒸留水に加えます
モヴィオル	1. 2.4 gのMowiolを6 gのグリセロールに加え、予熱したプレートで50 °C で1時間振とうします 2. 6 mLの蒸留水を加え、2 h で振とうします 3. Tris 200 mM(pH 8.5)12 mLを加え、10分間 で振とうします。 4. 5,000 × gで15分間遠心分離します5。分注して-20°Cで保存します。

表2:一次抗体。免疫染色に使用した一次抗体、クローン、および最適化された希釈液がリストされています。

の ) )

抗体	宿主種	希釈
バーフル1	兎	1/500
カルビンディン	兎	1/500
MAP2	鼠	1/1000
N-カドヘリン	鼠	1/1000
ネスティン	鼠	1/400
オリグ2	兎	1/500
パックス6	兎	1/400
SOX2 (英語	鼠	1/200
TBR1	兎	1/200
TBR2 (未定	兎	1/200
テュージ1	鼠	1/1000

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
3MMペーパー	WHA3030861	メルク
抗BARHL1	HPA004809	Atlas抗体と関連製品
抗カルビンジン D-28k 抗体	CB28	ミリポア
抗MAP2	M4403	シグマ
抗N-カドヘリン抗体	610921	BDトランスダクション
抗NESTIN抗体	MAB1259-SP	研究開発
抗OLIG2	マブネ50	ミリポア
抗PAX6	PRB-278Pの	コーヴァンス
抗SOX2	MAB2018	研究開発
抗TBR1	AB2261	ミリポア
抗TBR2	ab183991	アブカム
抗TUJ1抗体	801213	バイオレジェンド
カバースリップ 24x60mm	〒631-1575	VWRの
ダピ	10236276001	シグマ
ウシ胎児血清	A3840001	サーモフィッシャー
ウシの皮からのゼラチン	G9391	シグマ
ガラスコプリングジャー	E94	サーモフィッシャー
グリシン	MB014001	NZYtechの
モノチオグリセロール	M6154	シグマ
モヴィオル	475904	ミリポア	封入剤
トリトンX-100	〒9002-93-1	シグマ
Tween-20 (トゥイーン 20	P1379	シグマ
SuperFrost顕微鏡スライド	12372098	サーモフィッシャー	接着顕微鏡スライド

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