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1. iPSC/hESC 2D培養による脳オルガノイドの作製(0日目)
>注:このプロトコルは、幹細胞(SC)のメンテナンスがビトロネクチンまたはゲルトレックス基質を含むゼノフリー幹細胞メンテナンス培地(SCMM)で行われることを前提としています。代替の高タンパク幹細胞培養培地を使用する場合は、オルガノイド形成を開始する前に、SC培養物をSCMMに少なくとも2継代移行することが推奨されます。このプロトコールは、フィーダーベースのSC培養法では試験されていません。
- 通常のSCメンテナンス方法を使用して、培養物を50%〜70%の合流点にします。これは通常、継代後3〜4日ですが、これは培養方法や細胞株に依存する場合があります.
手記：オルガノイドのフル96ウェルプレートを作製するには、6ウェルプレートから約2ウェルが必要です。
- 明視野顕微鏡で10倍から20倍の倍率で培養物を検査し、検出可能な分化がなく、健康なコロニー形態を確認します。
- SCMMを温水浴で37°Cに戻し、50 μLのバイアル50 mM Y-27632(Rock阻害剤)と2 mLの酵素剥離試薬を室温で解凍します。
- 超低アタッチメント(ULA)U底96ウェルプレート、マルチチャンネルP200ピペット、および25 mL試薬リザーバーを準備します。
- 50 mLコニカルチューブにSCMM45 mLを分注し、50 mM Y-27632を45 μL加えます。トリチュレーションしてよく混ぜます。
- SCを含む2つのウェルを真空吸引し、P1000ピペットを使用して各ウェルに酵素を含まない剥離試薬1 mLを迅速に加えます。プレートを37°Cのインキュベーターで4分間インキュベートします。
- 処理したウェルを真空吸引し、P1000ピペットを使用して各ウェルに1 mLの酵素剥離試薬を加えます。
- プレートを37°Cのインキュベーターでさらに5分間インキュベー
トします。
- プレートを取り外し、処理したウェルを調べます。プレートを軽くたたいて、凝集した細胞を分割します。大きな細胞クラスターがまだ見える場合は、プレートを37°Cでさらに2分間インキュベートし、クラスターが肉眼で見えなくなるまでこの手順を繰り返します。
- 細胞が適切に解離されたら、各ウェルに1 mLのSCMMを添加して、解離酵素を不活性化します。4 mLの細胞懸濁液を50 mLのコニカルチューブにプールし、細胞計数用の少量のアリコートを取ります。
- メンテナンスプレートに残っている未処理のウェルは、37°Cインキュベーターに戻します。
- カウントしながら、細胞懸濁液を300 x gで5分間遠心分離します。
- 細胞の総数を決定し、60,000細胞/mL懸濁液を達成するために必要なSCMM + Y-27632溶液の量を計算します。
- 上清を慎重に真空吸引し、計算された量のSCMM + Y-27632溶液を追加します。5 mLピペットで5〜10回混合し、細胞懸濁液が均一になるようにします。
- 直ちに細胞懸濁液を試薬リザーバーに移し、マルチチャンネルP200ピペットを使用してULA U底96ウェルプレートの各ウェルに150μLをピペットで移します。これにより、96個のオルガノイドが産生され、各オルガノイドは最初は9,000個の細胞で構成されています。
- プレートを150 x gで1分間遠心分離します。
- プレートを37°Cのインキュベーターに入れ、プレートを48時間乱さないでください。
>2. 脳オルガノイドのメンテナンス (2日目)
- 50 mLコニカルチューブに17 μLの50 mM Y-27643 17 mL SCMMを調製します。SCMM + Y-27632溶液を温水浴で37°Cに温めます。
- オルガノイドプレートをインキュベーターから取り出し、75 μLに設定したマルチチャンネルP200ピペットを使用して、ウェルの1列目の端から培地をゆっくりと引き上げます。培地が引き出されたら、培地を素早くウェルに戻し、緩んだ細胞やオルガノイドを持ち上げます。これを各行に対して繰り返します。
手記：この技術は、以下「分散液」と呼ばれ、細胞の破片とオルガノイドを浮遊物に持ち上げます。オルガノイドは急速に井戸の底に沈みますが、小さな破片は懸濁したままであるため、培地交換でオルガノイドを取り除くことができます。これにより、培養中にオルガノイドが細胞の破片に留まるのを防ぐことができます。
- すべてのウェルが分散した後、オルガノイドが各ウェルの底に沈んだことを確認するために15秒待ちます。
- マルチチャンネルP200ピペットを使用して、各ウェルから75 μLの培地をゆっくりと慎重に吸引し、廃棄物リザーバーに分注します
手記：ほとんどのユーザーは、定期的な授乳中にオルガノイドを吸引することがあります。これは、約 1% の確率で発生する可能性があります。実験時点まで十分な数のオルガノイドが生存するように、それに応じて計画してください。
- SCMM + Y-27632溶液を試薬リザーバーに移し、マルチチャンネルP200ピペットを使用して各オルガノイドウェルに150 μLを分注します。
- プレートを37°Cのインキュベーターに戻します。
>3. 脳オルガノイドの維持 (3日目)
- 17 mLのSCMMを37°Cに温めます(今回はY-27643を使用しないでください)。
- マルチチャンネルP200ピペットを100 μLにセットした状態で、オルガノイドプレートのすべてのウェルを分散させます(ステップ2.2を参照)。オルガノイドが井戸の底に沈んでいることを確認するまで15秒待ちます。
- 廃棄物リザーバーを準備し、温めたSCMMをソースリザーバーに移します。
- 各ウェルから125 μLの培地を慎重に吸引し、マルチチャンネルP200ピペットを使用して150 μLの新鮮なSCMMと交換します。
- プレートを37°Cのインキュベーターに戻します。
>4. 脳オルガノイドのメンテナンス (4日目+)
>注:この定期メンテナンスは、感染するまで隔日で実施してください。
- 4日目に給餌を開始する前に、神経誘導(NI)培地を準備します。
- 2 mg/mL ヘパリンの 250 μL アリコートと 100X N-2 サプリメントの 5 mL バイアル 1 本を解凍します。250 μL のヘパリン、5 mL の 100X N-2、5 mL の 100X Minimum Essential Medium-Non-Essential Amino Acids (MEM-NEAA) を 500 mL の Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 (DMEM/F12) + GlutaMAX に加えます。滅菌 500 mLフィルターで混合溶液をろ過します.
注:使用しないときはNIを4°Cに保ってください。NIは、新鮮な培地を準備する前に最大2週間持続します。
- NI培地17 mLを37°Cに温めます。
- マルチチャンネルP200ピペットを100 μLにセットした状態で、オルガノイドプレートのすべてのウェルを分散させます(ステップ2.2を参照)。オルガノイドが井戸の底に沈んでいることを確認するまで15秒待ちます。
- 廃棄物リザーバーを準備し、温めたNIをソースリザーバーに移します。
- 各ウェルから125 μLの培地を慎重に吸引し、マルチチャンネルP200ピペットを使用して125 μLの新鮮なNIと交換します。
- プレートを37°Cのインキュベーターに戻します。
5. ジカウイルス(ZIKV)によるオルガノイド感染 (~24日目)
注:約3週間の分化後、オルガノイド内に大きな神経上皮構造とロゼットが見えるようになり、ZIKV感染に非常に敏感になります。
- Earle's 1X Balanced Salt Solution(EBSS)、1X Phosphate-buffered Saline(PBS)、およびNIを37°Cの温水浴に持ち込みます。
- 1X EBSS中の既知の濃度のZIKVを標的感染の多重度(MOI)に希釈します
手記：ウイルスの用量反応を達成するためには、さまざまなMOIの滴定が推奨されます。これはウイルス株によって異なる場合があります。ATCC VR-1838 および ATCC VR-1843 の場合、一般的な MOI 値は 0.1 から 10 の範囲です。
- オルガノイドウェルからすべての培地を、シングルチャンネルP200ピペットを使用して慎重に取り出します。オルガノイドを洗浄するために、P200マルチチャンネルピペットを使用して、各ウェルに200 μLの1X PBSを素早く加えます。
- オルガノイドウェルからすべての培地を、シングルチャンネルP200ピペットを使用して慎重に取り出します。50 μLの1X EBSSのみ(模擬感染)またはZIKVウイルス溶液をウェルに素早く加え、オルガノイドが完全に沈んでいることを確認します。研究のために感染する各オルガノイドについて繰り返します。
- プレートを37°Cのインキュベーターに戻し、2時間
手記：この期間、模擬感染したオルガノイドをインキュベートしても、乱されていないオルガノイドと比較して、オルガノイドの成長に大きな影響を与えることはありません。
- ウイルスインキュベーションが完了する約30分前に、25 mLのNIを50 mLのコニカルチューブに分注し、温水浴で37°Cにします。
- ウイルスへの曝露が完了したら、オルガノイドを各ウェルごとに200 μLの1X PBSで洗浄し、オルガノイドを15秒間沈降させてから、シングルチャンネルP200ピペットを使用して1X PBSを除去します。
- 200 μLの新鮮なNIを各ウェルに加え、インキュベーターに戻します。
- オプション:0日目の時点では、感染の1時間後にオルガノイドを画像化することができます。
- 分散法を使用して、125 μL NIを隔日で交換して培養を続けます(ステップ4を参照)。使用済みのメディアやチップには感染性のZIKV粒子が含まれているため、必ず適切に廃棄してください。