二重染色による小脳ニューロン培養におけるニューロン生存率の評価

要約

出典:Jiajia, L., et al. 小脳顆粒ニューロン培養におけるフルオレセインジアセテート-ヨウ化プロピジウム二重染色を用いたニューロン生存率の評価。J. Vis. Exp.(2017年)。

このビデオは、フルオレセインジアセテート(FDA)とヨウ化プロピジウム(PI)の二重染色を使用して、小脳顆粒ニューロンとグリア細胞の混合培養からニューロンを特定する方法を示しています。生きているニューロンは緑色に、死んだニューロンは赤く見えます。

プロトコル

1. FDA-PIの二重染色と小脳顆粒ニューロン(CGN)培養

1. 10 mLのリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に20 μLのFDA原液(最終濃度:10 μg/mL)と50 μLのPI原液(最終濃度:50 μg/mL)を加えて、フルオレセインジアセテート-ヨウ化プロピジウム(FDA-PI)ワーキング溶液を調製します。ボルテックスで混ぜて、これを氷の上に置きます.
   手記：使用直前にFDA-PIワーキングソリューションワーキングソリューションを新たに調製します。
2. 細胞培養プレートをインキュベーターから取り出します。氷の上に置きます。
3. 培地を吸引し、冷たいPBSと交換します.
   手記：溶液の変更はゆっくりと慎重に行う必要があります。ピペットチップで細胞に触れないでください。
4. 冷たくなったPBSを吸引し、冷たくなったFDA-PI(12ウェル細胞培養プレートの場合は500 μL/ウェル、6ウェル細胞培養プレートの場合は1 mL/ウェル)と交換します。氷の上に5分間置きます。
5. FDA-PIを吸引し、冷たPBS(12ウェル細胞培養プレートの場合は100 μL/ウェル、6ウェル細胞培養プレートの場合は50 μL/ウェル)を加えます。
   手記：画像を撮影するときは、細胞を乾燥させないでください。
6. 蛍光顕微鏡で画像を撮影します。通過帯域が450 - 490 nmの励起フィルタを使用します。FDAとPIの蛍光発光をそれぞれ520nmと620nmで検出します。同じ条件下で、蛍光顕微鏡の位相コントラストモードを使用して、常光下で画像を撮影します.
   手記：FDA-PI後15分以内に画像を撮影してください。露光時間は100〜300ミリ秒で、アナログゲインは2.8倍です。

2. 神経細胞の生存率の評価

1. FDA-PI二重染色の場合、グラフィックエディタソフトウェアでFDA陽性層をPI陽性層にドラッグすることにより、異なる蛍光フィルターでフィルタリングした後に検出された細胞の画像を重ね合わせます。
   1. 「レイヤー」パネルの「不透明度」フィールドに「50%」を入力して、FDA陽性レイヤーの不透明度を調整します。「レイヤー」メニューの「表示をマージ」ボタンをクリックして、2つのレイヤーをマージします。オーバーレイ画像のコントラストを設定するには、[Image]の下の[Contrast]フィールドに「50」と入力します。「調整」 |「明るさ/コントラスト」 オーバーレイ画像にFDAおよびPIのダブルポジティブセルがないことを確認してください。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
ウシ胎児血清	ギブコ	10099141	高品質のFBSは文化に不可欠です
100×グルタミン	ギブコ	25030081
100×抗菌薬	ギブコ	15240062
BMEミディアム	ギブコ	21010046
フルオレセインジアセテート	シグマ	F7378
ヨウ化プロピジウム	シグマ	P4170
ウサギ抗GAP43抗体	アブカム	AB75810
マウス抗GFAP抗体	細胞シグナル伝達	3670
パスツールピペット	ボラック	Z310727	使用前に先端を丸く燃やしてください
6ウェル細胞培養プレート	TPPとは	Z707759	培養には高品質な細胞培養プレートが欠かせません
フィルター	ミリポア	SLGP033RB
ピペット5 ml	エクセルバイオ	CS017-0003
ピペット10 ml	エクセルバイオ	CS017-0004
CO2インキュベーター	サーモサイエンティフィック	311
蛍光顕微鏡	ニコン	TI-S
蛍光フィルターとエミミッションキューブ	ニコン	B-2A、G-2A、UV-2A
写真ソフト	ニコン	NISエレメント
グラフィックエディタsofteware	アドービ	フォトショップCS
画像処理ソフトウェア	NIHの	イメージJ

型 名 名