免疫染色によるショウジョウバエ脳のキノコ体ニューロンの可視化

要約

出典:Kelly, S. M., et al.成虫のショウジョウバエの脳におけるキノコ体と光受容体ニューロンの解剖と免疫蛍光染色。J. Vis. Exp. (2017).

このビデオは、突然変異したショウジョウバエの脳のキノコ体の表現型欠損を視覚化するための詳細な免疫染色プロトコルを示しています。このプロトコルには、キノコ体の適切な形態学的および機能的発達を促進する軸索誘導に関与するタンパク質であるFas2に対する抗体を使用することが含まれます。

プロトコル

1. 固定と免疫蛍光染色の手順

1. p200ピペットを使用して、解剖した脳を9ウェルディッシュからPTN(0.1 M Sodium Rhorium Buffer pH 7.2, 0.1% nonionic surfactant)で希釈した0.5 mLの4%パラホルムアルデヒドを充填した0.5 mLの微量遠心チューブに移します。同じ遺伝子型の少なくとも10〜15個の脳を1本の微量遠心チューブに組み合わせることができます。残りのすべてのステップ(スライドへの脳の取り付けまで)は、0.5mlの微量遠心チューブで完了します><。 注意：パラホルムアルデヒド(PFA)はドラフトで取り扱ってください。PFA廃棄物は適切に保存および処理する必要があります。ガラスアンプルで購入したパラホルムアルデヒドの20%は、マイクロ遠心チューブに分注し、必要になるまで-20°Cで保存することができます。
2. ドラフト内で、室温で低速ロッキングしながら、脳を4%パラホルムアルデヒドで20分間インキュベートします。
3. 固定後、重力によって脳が微量遠心チューブの底に落ち着くのを待ちます.
   手記：脳は時々微量遠心チューブの側面にくっつくことがあります。これが発生した場合は、通常、人差し指と親指の間でチューブを横方向に回転させるか、ベンチのチューブを軽くたたいて脳の沈み込みを促進すると便利です。
4. p1000ピペットを使用して固定液を取り出し、500 μLのPTNで2回の「クイック」洗浄を行い、洗浄の合間に脳が微量遠心チューブの底に落ち着くようにします。これらの迅速な洗浄中に、すべての脳が重力によって微量遠心チューブの底に落ち着いたら、PTNをすぐに新しいバッファーと交換できます。追加の洗浄時間は必要ありません.
   手記： 通常、チューブ内に余分なバッファーを残すことは、脳の除去を危険にさらすよりも好ましいです。ピペットチップの慎重な検査は、チューブから誤って脳が取り外されていないことを確認するためにしばしば必要になります。脳が誤ってチップにピペットで挿入された場合は、マイクロ遠心チューブに分注し、脳が落ち着くのを待ってから、残っているPTNの除去を続けます。
5. 最後のクイック洗浄後、p1000ピペットを使用して3回の「長時間」洗浄を行います:500μLのPTNを加え、ロッカー/ニューテーターで室温で20分間洗浄します。今後の「長時間」の洗濯はすべて20分間行う必要があります
   手記：固定ブレインは、これらの洗浄後、PTNで4°Cで一晩保存できます。
6. p1000ピペットを使用して最後の洗浄液を取り出し、ロッカーまたはニューテーターで脳を室温で0.5 mLのブロッキング溶液[PTN + 5%正常ヤギ血清(NGS)]で室温で少なくとも30分間インキュベートします。
   1. ヤギの二次抗体は、後続のプロトコールステップで使用されます。別の動物種由来の二次抗体を使用する場合は、ブロッキング溶液および抗体溶液に(NGSではなく)その動物種由来の正常な血清を使用する必要があります。
7. p1000ピペットを使用してブロッキング溶液を取り出し、PTNで希釈した一次抗体(PTN + 5% NGS + 希釈した一次抗体)を加えます。一次抗体を初めて使用する場合は、その抗体の最適な希釈率を経験的に決定する必要があります
   手記：キノコ体のニューロンを可視化するためには、通常、Fas2を認識する抗体が使用されます。これらの抗体は、Developmental Studies Hybridoma Bank(DSHB)から抗体1D4として入手でき、PTN + 5% NGSで1:20に希釈する必要があります。
8. ロッカー/ニューテーター上の一次抗体溶液で脳を4°Cで2〜3晩インキュベー
トします。
9. 一次抗体とインキュベートした後、脳を微量遠心チューブの底に沈殿させてから、一次抗体溶液を取り出します。
10. p1000ピペットを使用して、ステップ1.4および1.5で説明したように、0.5 mLのPTNで2回の「クイック」洗浄と3回の「長時間」20分間の洗浄を行い、各洗浄の間に脳が重力によって微量遠心チューブの底に落ち着くように注意深くします。
11. 適切な蛍光標識二次抗体を用いて、脳を室温で3時間インキュベートします。二次抗体は通常、0.5 mLのPTN + 5% NGSで1:200.
    の濃度で希釈されます。 手記：蛍光二次抗体を添加したら、実験の残りの間、脳を暗闇に閉じ込めておく必要があります。
12. 二次抗体のインキュベーション後、脳を微量遠心チューブの底に沈殿させ、二次抗体溶液を取り出します。
13. 上記のステップ1.4および1.5で説明したように、0.5 mLのPTNで20分間の「クイック」洗浄を2回、20分間のロング洗浄を3回行い、各洗浄の間に脳がマイクロ遠心チューブの底に落ち着くように注意深く待ちます。
14. 3回目の「長時間」20分間の洗浄後、p200ピペットを使用してできるだけ多くのバッファーを取り除きます。
15. 75 μLの蛍光退色防止用封入剤を脳に加えます。ピペットの頭脳とピペットチップに封入した培地を一度混ぜ合わせます。脳がマイクロ遠心チューブのキャップや側面に引っかかる可能性があるため、チューブを反転させないでください。
    手記： ブレインを封入剤に懸濁した後、チューブをアルミホイルで包んで蛍光色素の焼入れを遅らせ、4°Cで一晩保存することができます。必要に応じて、脳は4°Cで数日間保存できますが、できるだけ早くスライドに取り付けるのが理想的です。

>2. 成虫のD. melanogasterの脳を顕微鏡スライドとイメージングに実装

する

1. 「ブリッジ」スライドを作成します。2つの「ベース」カバースリップを約1cm離して、正に帯電したスライドに配置します。スライドの正に帯電した面が上を向いていることを確認します。図1Aに示すように、カバースリップをマニキュアでスライドに接着します。通常、各ベースカバースリップの3つの外側の端をマニキュアで密封すると、封入剤がこれらのベースカバースリップの下に吸い付かないようにするのに役立ちます。先に進む前に、マニキュアを完全に乾かします(10〜15分)。
2. スライドを実体顕微鏡の下に置き、解剖した脳を含む封入剤溶液を2つのカバースリップの間のスペースにピペットで移します。コントラストを高めるには、グースネックライトをベンチトップと平行になるように操作すると便利です。
3. ピペットを使用してスライドから余分な封入剤を取り出し、スライドから脳をピペットで動かさないように注意してください。
4. 余分な封入メディアを吸い取ります。これにより、次のステップで脳をより正確に配置できるようになります。
5. 一対の鉗子と実体顕微鏡を使用して、触角ローブが上を向くように、脳をスライド上にグリッドパターンで配置します。
6. カバースリップ(「ブリッジ」)を脳の上に置きます(図1A)。マニキュアを使用して、ブリッジカバースリップの側面が「ベース」カバースリップに接触する場所をシールします。
7. p200ピペットを使用して、ブリッジの下の中央キャビティに新しい封入剤をゆっくりと充填します(図1B)。センターカバースリップのオープンエッジに一度に1滴ずつ置き、封入剤がセンターブリッジカバースリップの下に吸い付くようにします。キャビティ全体が封入剤で満たされるまで続け、次に透明なマニキュアで上部と下部を密封します。
8. マニキュアが乾いたら、すぐにスライドをイメージするか、-20°Cの耐光性に優れたタイトなスライドボックスに保管します。
9. 1週間以内に、選択した蛍光二次抗体に適した励起レーザーとフィルターキューブを備えたレーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して脳を画像化します。キノコ体ニューロンのZスタック画像は、通常、20倍または40倍の対物レンズを使用して取得されます。

結果

図 1.免疫蛍光イメージングの準備のための脳のマウント。(A)脳は、脳が平らになるのを防ぐために、ブリッジカバー付きのSuperFrost Plusスライドに取り付けられています。2枚の「ベース」カバースリップをSuperFrost Plusの正電荷のスライドに接着し、透明なマニキュアを塗った状態で、解剖した脳をその間に置きます。透明な「ブリッジ」カバースリップを脳の上に配置し、ベースカバースリップに接着します。(B)マニキュアが乾いたら、Vectashieldをブリッジの下にゆっくりとピペットで入れて、二次抗体の蛍光を維持します。次に、透明なフィンガーマニキュアを使用して、「ブリッジ」カバースリップの上部と下部をシールします。

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
マイクロダイセクション鉗子/ピンセット	テッド・ペラ	505 NM
シルガード料理	リビングシステム計測	DD-50-S-BLKの	amazon.com から利用可能
Fas2 抗体	Developmental Studies Hybridoma Bank (発達研究ハイブリドーマバンク	1D4
Chaoptin 抗体	Developmental Studies Hybridoma Bank (発達研究ハイブリドーマバンク	24B10
GFP抗体	アベス研究室	GFP-1010
Alexa488ヤギアンチマウス 二次抗体	サーモフィッシャー	A-11001
Alexa488ヤギアンチチキン 二次抗体	サーモフィッシャー	A-11039
Alexa647 ヤギ抗マウス二次抗体	サーモフィッシャー	A-21236
20%パラホルムアルデヒド	電子顕微鏡サービス	RT15713
ベクタシールド	ベクターラボ	H-1000
SuperFrost Plusスライド	サーモフィッシャー	99-910-01
カバースリップ	サーモフィッシャー	12-553-454
Naリン酸緩衝液 monobasic	シグマ	S3139
リン酸Naバッファー二塩基性	シグマ	S3264
トリトンX 100	シグマ	X100-100ミリリットル
フィンガーマニキュア	電子顕微鏡サービス(EMS)	72180
実体顕微鏡	ライカ S6D と KL300 LED 光源
9ウェルディッシュ(スポットプレート)	VWRの	89090-482
ニューテーター/ロッカー	漁夫	22-363-152 または 88-861-041
35mmディッシュ	ジェネシー・サイエンティフィック	32から103
シルガード	漁夫	50-366-794
キムワイプ	漁夫	06-666
潜在的な固定バッファー
PTNバッファ			0.1M リン酸NaPhosphate、pH 7.2、0.1% Triton-X-100、通常、0.1M NaPhosphateバッファーを0.5 L分注し、必要に応じて一度に50 mL分注
ブルーミントンから入手可能なフライストック
エラヴ (c155)-GAL4		BL458	汎ニューロンGAL4ドライバー
w*;;;OK107-GAL4		BLの854	すべてのキノコ体ニューロンのGAL4ドライバー(OK107-GAL4挿入は4番目の染色体上にあります)
y(1)、w(67c23)、c739-GAL4		BLの7362	アルファローブとベータローブのGAL4ドライバー(第2染色体上)
y(1)、w(67c23)、c739-GAL4、UAS-CD8-GFP		BLの64305	アルファおよびベータローブ用のGAL4ドライバは、UAS-CD8-GFPも含
w*; 201Y-GAL4		BLの4440	主にキノコ体(第2染色体上)のガンマローブのためのGAL4ドライバー
y(1)、w(67c23)、201Y-GAL4、UAS-CD8-GFP		BLの64296	きのこのボディのγの葉のためのGAL4ドライバーは、またUAS-CD8-GFPを含んでいます

) ) します。 の の んでいます